Name: in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00
Duration: 12 min 15 s
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Forschung im Labor von MT wird durch Zuschüsse aus dem National Science Foundation (DBI-0820610 und IOS-1022102) und der NY Department of Health (NYSTEM-C024308) unterstützt. CM erhielten Postdoc-Stipendien des spanischen Ministeriums für Erziehung und Wissenschaft (2007-0937) und die Stiftung Rafael del Pino, Spanien.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die in situ Hybridisierung hier skizzierten erlaubt die direkte Visualisierung der räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von jedem Gen von Interesse mit großer zellulärer Auflösung, hohe Sensitivität und Spezifität. Das Protokoll erlaubt keine quantitativen Vergleich der Expression von Genen. Allerdings kann die Methode eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung Gradienten der Genexpression innerhalb eines Gewebes 8, 18, ​​die nicht mit den meisten anderen Methoden zur Analyse der Genexpression möglich aufzudecken. Das Protokoll umfasst viele Schritte, die machen die Fehlersuche problematisch sein kann. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die Fixierung des Gewebes sowie die Auswahl und Markierung der Sonde. Schlecht infiltrierten Gewebe und Sonden mit geringen DIG Einbau wird Ausbeute sehr schwachen Signalen, die schwer zu obigen Hintergrund erkennen kann. Für jedes neue Gen von Interesse, ist es ratsam, ein paar verschiedene Sonden, die aus verschie abgeleitet versuchenmieten Regionen der Niederschrift. Gelegentlich können auch zwei oder drei Sonden gezielt verschiedene kleinere Regionen des Gens müssen kombiniert werden, um eine starke und spezifische Hybridisierung Signal zu erhalten. Darüber hinaus sind die Hybridisierungsbedingungen, wie die Temperatur und die Zusammensetzung der Hybridisierungspuffer, kann für jedes Gen oder Gewebe zu senken oder erhöhen Sie die Hybridisierungsstringenz optimiert werden. Auch die Protease-Behandlung Schritt ist eine Variable und kann geändert werden, um das Protokoll für die verschiedenen Pflanzenarten oder für die Detektion von Transkripten mit sehr geringer Menge anzupassen. Die Einbeziehung sowohl positive als auch negative Kontrolle Sonden wird hilfreich sein bei der Identifizierung von problematischen Punkte des Protokolls. Das Verfahren ist für Paraffin eingebettete Gewebeschnitte Anlage optimiert, sondern mit geringfügigen Modifikationen auch für Ganzkörper-Mount verwendet werden in-situ-Hybridisierung. Obwohl häufig in Tierversuchen 19, whole mount in situ Hybridisierung verwendet werden l werdenimited zu pflanzlichen Geweben, die leicht infiltriert werden können, wie Embryonen, Wurzeln oder jungen meristematischen Gewebe 20,21. Das Protokoll kann auch leicht modifiziert werden, um gleichzeitig zu erkennen zwei verschiedene mRNAs oder lokalisieren Transkripte neben Proteinen 15,22,23. Schließlich ist es möglich, die Anwendung dieser Methode auf die Visualisierung von kleinen RNA-Expression in Pflanzen zu erweitern. miRNA-Expressionsmuster wurden anhand dieses Protokoll in beide Mais und Arabidopsis 8,14. In jüngerer Zeit haben die in vitro transkribiert Sonden ersetzt worden handelsüblichen DIG-markierten Locked Nucleic Acid (LNA) Oligo Probes mit Zunahme Signalempfindlichkeit 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Bemerkungen </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4 Unzen </td><td> Fischer </td><td> 23-244-256 </td><td> Toluol-based 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Fischer </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Pfad Paraplast Plus- </td><td> Fischer </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + Nylonmembran Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT; 40 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase-Free DNase; 1 U / ul </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-markierten Kontroll-RNA </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA-Polymerase 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> lösen sich in Glycerin 50% Tris 100 mM pH 8,0 </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Hitze bis 70 ° C in TBS-Puffer </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente aus Schaf-150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP-Stammlösung </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Quick Spin RNA Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA aus E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Deionisiertes Formamid </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Protease aus Streptomyces griseus Typ XIV </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Verdünnen Sie in milliQ Wasser-und pre-Digest 4 Stunden bei 37 ° C </td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Verdünnen in Wasser, pH 8,0 mit HCl bringen </td></tr><tr><td> Essigsäureanhydrid </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat Natriumsalz aus Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Dextransulfat sollte auf 80 ° C erhitzt werden, sich aufzulösen. </td></tr><tr><td> Denhardt Lösung 50x Konzentrat </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin Y Dinatriumsalz </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Lösen Sie in 96-100% Ethanol bis zur Sättigung </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol absolut 200 Proof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phenol / Chloroform </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bodenformen </td><td> Elektronische Microsocpy Wissenschaft </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Embedding Ringe </td><td> Fischer </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml Einweg Szintillationsgefäße, mit Kappen </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Probe-on-plus-Objektträger </td><td> Fischer </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Deckgläser 24x50 mm </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman-Papier 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Drei Glasschalen und einem stainless Stahlschlitten Rack </td><td> Elektronische Microsocpy Wissenschaft </td><td> 71420-25 </td><td> Zwei Glas gewölbt sind für histoclear Behandlung notwendig ist und die letzte ist für den Essigsäureanhydrid Behandlung verwendet </td></tr><tr><td> 18 saubere Kunststoff-Behälter </td><td> Elektronische Microsocpy Wissenschaft </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 oder 3 große, flache Kunststoffboxen mit verschließbaren Deckeln </td><td></td><td></td><td> erforderlich für die Hybridisierung und Antikörper-Schritte </td></tr><tr><td> Feine Pinsel </td><td></td><td></td><td> Hilfe Übergabe Wachsbänder </td></tr><tr><td> Mikrotom </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Selbstreinigende Trockensauger System </td><td> Welch </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Slide wärmer </td><td> Fischer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heizblock </td><td></td><td></td><td> benötigt bei 60 ° C und 85 ° C</td></tr><tr><td> Brutschrank bei 58-60 ° C </td><td> Fischer </td><td></td><td> Für die Schritte mit geschmolzenem Paraplast </td></tr><tr><td> Backöfen oder Wasserbäder für 55 ° C und 37 ° C </td><td> Fischer </td><td></td><td> Müssen zwei durch die schnellen Wechsel zwischen den Temperaturen </td></tr><tr><td> Zentrifuge (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laborabzugsregelung </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants

Mit den Fortschritten in der Genomforschung der letzten zehn Jahre hat Pflanzenbiologie zahlreiche Studien präsentiert großflächige quantitative Analysen der Genexpression zu sehen. Microarray und Sequenzierung der nächsten Generation Ansätze werden verwendet, um entwicklungsbedingten, physiologischen und Stress-Antwort-Prozesse zu erforschen, zu sezieren epigenetischen und kleine RNA Wege und bauen große Genregulationsnetzwerken 1-3. Während diese Techniken die gleichzeitige Analyse von großen Gen-Sets zu erleichtern, sie bieten in der Regel eine sehr begrenzte raum-zeitlichen Auflösung von Veränderungen der Genexpression. Diese Beschränkung kann teilweise entweder mit Profiling-Methode in Verbindung mit lasermicrodissection oder Fluoreszenz-activated cell sorting 4-7 überwunden werden. Doch das Verständnis der biologischen Rolle eines Gens, ist das Wissen um seine raum-zeitliche Muster der Expression auf zellulärer Auflösung von wesentlicher Bedeutung. Insbesondere bei der Untersuchung der Entwicklung oder die Auswirkungen von Umwelt-stimuli und Mutanten können die detaillierte Analyse eines Gens Expressionsmuster unverzichtbar geworden. Zum Beispiel können subtile quantitative Unterschiede in der Expression von wichtigen regulatorischen Genen zu dramatischen Phänotypen führen, wenn mit dem Verlust oder Gewinn des Ausdrucks in bestimmten Zelltypen assoziiert. Verschiedene Methoden werden routinemäßig für die detaillierte Untersuchung der Genexpression verwendet. Man ist durch die Analyse von transgenen Reporter Linien. Eine solche Analyse kann jedoch zu zeitaufwändig bei der Analyse mehrerer Gene oder arbeiten in Pflanzen widerspenstigen zur Transformation. Darüber hinaus ist eine unabhängige Validierung, um sicherzustellen, dass die Transgenexpression Muster, das aus dem endogenen Gen imitiert in der Regel erforderlich. Immunhistochemische Proteinlokalisierung oder mRNA in situ Hybridisierung Gegenwart relativ schnell Alternativen für die direkte Visualisierung der Genexpression in Zellen und Geweben. Letzteres hat den entscheidenden Vorteil, dass es leicht sein kann used auf jedem Gen von Interesse. In-situ-Hybridisierung ermöglicht den Nachweis von Ziel-mRNAs in den Zellen durch Hybridisierung mit einer markierten anti-sense RNA-Sonde durch in vitro Transkription des Gens von Interesse erzielt. Hier skizzieren wir ein Protokoll für die in situ-Lokalisierung der Genexpression in den Pflanzen, die hoch Sensitivität und Spezifität wird. Es ist für die Verwendung mit Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebetteten Abschnitte, die hervorragende Erhaltung der Histologie zu geben, und DIG-markierten Sonden, visualisiert durch Immun-Detektion und alkalischer Phosphatase kolorimetrische Reaktion optimiert werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich an einer Reihe von Geweben aus einer breiten Palette von Pflanzenarten angewendet wird, und kann verwendet werden, um die Expression von mRNAs sowie kleine RNAs 8-14 analysieren.

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In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Die<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine direkte Lokalisierung von mRNA und kleinen RNA-Expression auf zellulärer Ebene mit hoher Sensitivität und Spezifität. Das Verfahren ist für Paraffin eingebettete Gewebeschnitte Anlage optimiert, ist für eine breite Palette von Pflanzen und Gewebe und kann innerhalb von zehn Tagen abgeschlossen sein.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

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Biologie

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Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

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