Name: in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00
Duration: 12 min 15 s
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MTの研究室では、国立科学財団（DBI - 0820610およびIOS - 1022102）と健康のニューヨーク州省（NYSTEM - C024308）からの補助金によってサポートされています。 CMは、教育と科学（200​​7〜0937）と財団ラファエルデルピノ、スペインのスペイン省からポスドクを受けた。

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A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis.">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li><li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex.">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで概説したin situハイブリダイゼーション法偉大な携帯電話の解像度、高感度および特異性に関心の任意の遺伝子の時空間発現パターンの直接可視化することができます。プロトコルは、遺伝子間の発現レベルの定量的な比較を許可しません。しかし、法の高感度と分解能は、遺伝子発現を解析の大部分の他の方法では不可能な組織8、18、内遺伝子発現の勾配を明らかにすることができます。 プロトコルは、トラブルシューティングが問題にすることができます多くの手順が含まれています。プロトコルの最も重要なステップは、組織の固定とプローブの選択とラベリングです。低DIGの取り込みと不完全浸透し組織とプローブは、バックグラウンドの上に検出することが困難になる可能性のある非常に微弱な信号が得られます。興味の各々の新しい遺伝子の場合、それはdiffeから派生したいくつかの異なるプローブを試してみることをお勧め転写産物の領域を借りる。時折、遺伝子の別の小さな領域を標的とする二、三のプローブが強いと、特定のハイブリダイゼーションシグナルを得るために組み合わせることが必要な場合があります。さらに、そのような温度およびハイブリダイゼーションバッファーの組成などのハイブリダイゼーション条件は、、それぞれの遺伝子またはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを下げるか上げるために組織を最適化することができます。また、プロテアーゼ処理のステップは、変数であり、異なる植物種のためにまたは非常に低濃度と転写産物を検出するためのプロトコルを適合させるために変更することができます。両方陽性および陰性コントロールプローブの包含は、プロトコルの問題のポイントを識別する助けになるでしょう。 手順は、パラフィン包埋植物の組織切片用が若干変更して最適化されてin situハイブリダイゼーションホールマウントにも使用できます。広く動物研究19で使用されているが、in situハイブリダイゼーション全体のマウントはLになりますこのような胚、根や若い分裂組織20,21として簡単に潜入することができるの植物組織、にimited。プロトコルは、簡単に同時に二つの異なるmRNAを検出したり、蛋白質15,22,23と一緒に成績証明書をローカライズするために変更することができます。最後に、それは、植物におけるsmall RNAの発現パターンの可視化には、このメソッドのアプリケーションを拡張することが可能です。 miRNAの発現パターンは、トウモロコシとシロイヌナズナ8,14の両方でこのプロトコルを使用して決定されている。さらに最近では、in vitro転写されたプローブで 、市販のロックされた核酸（LNA）信号の感度18、24を増加させるオリゴプローブのDIG標識に置き換えられています。

<table border="1"><tbody><tr><th>製品</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>解説</th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4オンス</td><td>フィッシャー</td><td> 23-244-256 </td><td>トルエンベースの8310から4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td>フィッシャー</td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td>組織パスParaplastプラス</td><td>フィッシャー</td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N +ナイロンメンブレンハイボンド- N + </td><td> GEヘルスケア</td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNaseのOUT、40 U /μL </td><td>インビトロジェン</td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNaseフリーのDNase、1 U /μlの</td><td>プロメガ</td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIGラベルされたコントロールRNA </td><td>ロッシュ</td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロッシュ</td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNAポリメラーゼ1,000 U </td><td>ロッシュ</td><td> 10810274001 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNAポリメラーゼ1,000 U </td><td>ロッシュ</td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ1,000 U </td><td>ロッシュ</td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td>のRNase </td><td>ロッシュ</td><td> 109142 </td><td>グリセロール50パーセントトリス100mMのpH8.0で溶解する</td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 1 096 176 </td><td> ° C TBSバッファーで70までの耐熱</td></tr><tr><td>羊150 Uから抗ジゴキシゲニン- AP、Fabフラグメント</td><td>ロッシュ</td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIPストック溶液</td><td>ロッシュ</td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td>ミニクイックスピンRNAカラム</td><td>ロッシュ</td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> E.からtRNAの大腸菌 </td><td>ロッシュ</td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td>トリトン® X - 100 </td><td>シグマ</td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween - 20を</td><td>シグマ</td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td>脱イオン化ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> 放線griseusタイプXIVからのプロテアーゼ</td><td>シグマ</td><td> P5147 </td><td> 37 MilliQ水とプレダイジェストで希釈して4時間° C </td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>シグマ</td><td> 90279 </td><td>水で希釈し、HClでpH8.0にもたらす</td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>シグマ</td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> ロイコノストック属からデキストラン硫酸のナトリウム塩。 </td><td>シグマ</td><td> D8906 - 5G </td><td>デキストラン硫酸℃で溶解するために80にまで加熱する必要があります。 </td></tr><tr><td>デンハルト溶液の50倍の濃縮</td><td>シグマ</td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清からアルブミン - ≥98％ </td><td>シグマ</td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td>エオシンY二ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> E4382 </td><td>飽和するまで96〜100％エタノールに溶解する</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対200プルーフ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノール/クロロホルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベース型</td><td>電子Microsocpy科学</td><td> 62352〜15 </td><td></td></tr><tr><td>埋め込みリング</td><td>フィッシャー</td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td>キャップと20ミリリットル使い捨てシンチレーションバイアル、 </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td>プローブオンプラススラ​​イド</td><td>フィッシャー</td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス24x50ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td>ワットマン濾紙3ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td>三ガラス皿一STAInlessスチールスライドラック</td><td>電子Microsocpy科学</td><td> 71420〜25 </td><td>二つのガラスはhistoclear治療のために必要なくぼみと最後のものは、無水酢酸の治療のために使用されています</td></tr><tr><td> 18清潔なプラス​​チック容器</td><td>電子Microsocpy科学</td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td>密閉式蓋つきの2つまたは3つの大型フラットプラスチックの箱</td><td></td><td></td><td>ハイブリダイゼーションおよび抗体の手順では必要</td></tr><tr><td>ファインブラシ</td><td></td><td></td><td>ワックスリボンを渡すのに役立ちます</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td></td><td></td><td>ライカ</td></tr><tr><td>セルフクリーニングドライ真空システム</td><td>ウェルチ</td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td>ウォーマーをスライドさせ</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td></td><td></td><td> 60 ° Cおよび85 ° Cで必要</td></tr><tr><td> 58〜60時インキュベーター° C </td><td>フィッシャー</td><td></td><td>溶融Paraplastと手順について</td></tr><tr><td> 55 ° Cと37 ° Cのオーブンまたは水浴</td><td>フィッシャー</td><td></td><td>温度の間にクイックチェンジによる2を必要とする</td></tr><tr><td>遠心（4 ° C - 20 ° C） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドラフト</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants

過去十年間のゲノム研究の進歩に伴い、植物の生物学は、遺伝子発現の大規模な定量的な分析を提示する多くの研究を見ている。マイクロアレイや次世代シーケンシングのアプローチは、発達、生理、ストレス応答のプロセスを調査エピジェネティクスとsmall RNAの経路を分析、及び1-3大規模な遺伝子調節ネットワークを構築するために使用されている。これらの技術は大規模な遺伝子セットの同時分析を容易にする一方で、彼らは一般的に遺伝子発現の変化の非常に限られた時空間解像度を提供しています。この制限は、部分的に4-7をソートlasermicrodissectionまたは蛍光活性化細胞と一緒にどちらかのプロファイリングメソッドを使用して克服することができます。しかし、完全に遺伝子の生物学的役割を理解するために、細胞の解像度での表現のその時空間パターンの知識が不可欠です。特に、開発や環境へのSTIの影響を研究するときmuliと変異体は、遺伝子の発現パターンの詳細な分析が不可欠になることができます。特定の細胞型における発現の損失または利得に関連付けられているときに例えば、キー調節遺伝子の発現レベルの微妙な量的な違いは、劇的な表現型につながることができます。 いくつかの方法は、日常的に遺伝子発現パターンの詳細な検査のために使用されています。一つは、トランスジェニックレポーターラインの分析を通じてです。このような分析は、しかし、複数の遺伝子を解析または変換に負えない所で作業する際に時間がかかるになることができます。また、導入遺伝子の発現パターンは内因性遺伝子のことを模倣することを保証するための独立した検証は、通常は必要です。 in situハイブリダイゼーション免疫組織化学的蛋白質の局在またはmRNAは、細胞や組織内の遺伝子発現の直接可視化するための比較的高速な代替案を提示。後者は、それが容易にuをすることができる明確な利点を持っています興味のある任意の遺伝子上のsed。situハイブリダイゼーションでは、目的の遺伝子のin vitro転写により得られたプローブを標識したアンチセンスRNAとのハイブリッド形成による細胞内で標的mRNAの検出を可能にする。 ここでは、非常に感度と特異的であり、植物における遺伝子発現の in situ局在のためのプロトコルの概要を示します。それは、パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋切片、組織学の優れた保全を与え、そして免疫検出し、アルカリフォスファターゼ比色反応により可視化DIGラベルされたプローブでの使用に最適化されています。このプロトコルは、正常な植物種の広い範囲から採取した組織の数に適用されている、とmRNAと同様の低分子RNA 8月14日の表現を分析するために使用することができます。

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In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

市販<em&gt;その場で</emここで説明する&gt;ハイブリダイゼーションプロトコールは、高感度と特異性を持つ細胞レベルでのmRNAと小さなRNAの発現の直接局在することができます。手順はパラフィン包埋植物の組織切片用に最適化され、植物や組織の広い範囲に適用可能である、と10日以内に完了することができます。

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

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