Name: in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00
Duration: 12 min 15 s
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MT의 연구실에서 연구는 국립 과학 재단 (DBI - 0820610 및 IOS - 1022102)와 건강의 뉴욕과 (NYSTEM - C024308)에서 기금에 의해 지원됩니다. CM은 교육과 과학 (2007-0937)와 재단 라파엘 델 피노, 스페인의 스페인 교육부에서 박사 장학금을 받았습니다.

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A., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+apical+embryonic+pattern+in+Arabidopsis.">The development of apical embryonic pattern in Arabidopsis.</a> Development. 125, 3027-3035 (1998).</li><li>Nogueira, F. T., Chitwood, D. H., Madi, S., Ohtsu, K., Schnable, P. S., Scanlon, M. J., Timmermans, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+small+RNA+accumulation+in+the+maize+shoot+apex.">Regulation of small RNA accumulation in the maize shoot apex.</a> PLoS Genet. 5, e1000320-e1000320 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 명시된 현장 하이브 리다이 제이션 방식의 좋은 세포 해상도, 높은 감도와 특이성과 관심의 유전자의 spatiotemporal 표현 패턴의 직접 시각화 수 있습니다. 프로토콜은 유전자 간의 표현 수준의 양적 비교를 허용하지 않습니다. 그러나, 방법의 높은 감도와 해상도가 유전자 발현을 분석 대부분의 다른 방법으로 가능하지 않은 조직이 8, 18, ​​내의 유전자 발현의 그라디언트를 공개하실 수 있습니다. 프로토콜 문제 해결은 문제가 만들 수있는 단계가 포함되어 있습니다. 프로토콜의 가장 중요한 단계는 조직의 고정 및 프로브의 선택과 라벨입니다. 낮은 발굴의 설립과 함께 저조한 침투 조직 및 프로브는 배경 위에 감지하기 어려울 수도 매우 약한 신호를 얻을 것입니다. 관심 각각의 새로운 유전자 들어, diffe에서 파생된 몇 가지 뚜렷한 프로브를 시도하는 것이 좋습니다명시 지역을 임대. 때때로, 유전자의 다른 작은 지역을 대상으로 두 개 또는 세 탐사선이 강하고 특정 하이브 리다이 제이션 신호를 얻기 위해 결합해야 할 수도 있습니다. 또한, 같은 온도와 하이브 리다이 제이션 버퍼 구성으로 하이브 리다이 제이션 조건, 각각의 유전자 또는 하이브 리다이 제이션 엄중을 낮추거나 높일 조직에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 단백 분해 효소 처리 단계는 변수이며 다른 식물 종 (种) 또는 매우 낮은 풍부한 성적의 검출을위한 프로토콜을 적응 변경할 수 있습니다. 모두 긍정적이고 부정적인 제어 프로브의 포함은 프로토콜의 문제 지점을 식별하는데 도움이 될 것입니다. 절차는 파라핀 - 임베디드 식물 조직 섹션에 최적화되어 있지만 사소한 수정은 현장 하이브리드화에서 전체 마운트에도 사용할 수 있습니다로. 널리 원위치 하이브리드화에서 동물 연구 19 전체 마운트에 사용되는 것은 있지만 리터 것입니다이러한 배아, 뿌리 또는 젊은 meristematic 조직 20,21 쉽게 침투 수있는 식물 조직에 imited. 프로토콜은 쉽게 동시에 두 개의 mRNAs를 검색하거나 단백질 15,22,23 함께 성적표를 집중하기 위해 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 식물의 작은 RNA 표현 패턴의 시각화에이 방법의 응용 프로그램을 확장하는 것이 가능합니다. miRNA 발현 패턴은 옥수수와 Arabidopsis 8,14 모두에서이 프로토콜을 사용하여 결정되었습니다. 최근 체외 베꼈는데 프로브에있는가에 의해 대체되었습니다 상용 파다 - 레이블 잠금 핵산 (LNA) oligo 프로브 그 증가 신호 감도 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> 제품 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 비고 </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4온스 </td><td> 어부 </td><td> 23-244-256 </td><td> 톨루엔 기반 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> 어부 </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 경로 Paraplast 플러스 </td><td> 어부 </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + 나일론 막 Hybond - N + </td><td> GE 헬스케어 </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT, 40 U / μL </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase - 무료 DNase, 1 U / μl </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> 발굴 - 라벨 컨트롤 RNA </td><td> 호슈 </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> 발굴 RNA 라벨 믹스 </td><td> 호슈 </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA 효소 1,000 U </td><td> 호슈 </td><td> 10810274001 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td> T3 RNA 효소 1,000 U </td><td> 호슈 </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA 효소 1,000 U </td><td> 호슈 </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase - A </td><td> 호슈 </td><td> 109,142 </td><td> 글리세롤 50% 트리스 100mM pH8.0에서 용해 </td></tr><tr><td> 시약을 차단 </td><td> 호슈 </td><td> 1 096 176 </td><td> ° C TBS 버퍼 70 개까지 열 </td></tr><tr><td> 안티 Digoxygenin - AP, 양 150 U의 팹 조각 </td><td> 호슈 </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP 재고 솔루션 </td><td> 호슈 </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> 미니 빠른 스핀 RNA 열 </td><td> 호슈 </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> E.에서 tRNA 대장균 </td><td> 호슈 </td><td> 109,541 </td><td></td></tr><tr><td> 트라 이튼 ® X - 100 </td><td> 시그마 </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 - 2​​0</td><td> 시그마 </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Deionized 포름 아미드 </td><td> 시그마 </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Streptomyces griseus 유형 XIV에서 프로 테아제 </td><td> 시그마 </td><td> P5147 </td><td> 37 milliQ 물, 사전 다이제스트 4 시간 만에 희석 ° C </td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> 시그마 </td><td> 90,279 </td><td> 물에 희석, HCL와 pH8.0 데리고 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 </td><td> 시그마 </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Leuconostoc 종에서 Dextran 황산 나트륨 소금. </td><td> 시그마 </td><td> D8906 - 5G </td><td> Dextran 황산은 ° C가 용해에 80 가열한다. </td></tr><tr><td> Denhardt의 솔루션 50x 컨센트레이트 </td><td> 시그마 </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민에서 - ≥ 98% </td><td> 시그마 </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin Y 나트륨 소금 </td><td> 시그마 </td><td> E4382 </td><td> 포화까지 96~100%의 에탄올에 용해 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 절대 200 증명 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페놀 / 클로로포름 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 기본 틀 </td><td> 전자 Microsocpy 과학 </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> 퍼가기 반지 </td><td> 어부 </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 모자와 20ml 일회용 섬광 튜브, </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> 프로브 -에서 - 플러스 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> 마이크로 커버 24x50 mm 안경 </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> 워트 먼지 용지 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> 세 유리 요리 한 - 안녕 -nless 철강 슬라이드 선반 </td><td> 전자 Microsocpy 과학 </td><td> 71420-25 </td><td> 두 유리 histoclear 치료에 필요한 걸려, 마지막 하나는 아세트산 무수물 치료에 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 18 깨끗한 플라스틱 용기 </td><td> 전자 Microsocpy 과학 </td><td> 71,402 </td><td></td></tr><tr><td> sea​​lable 뚜껑 2 개 또는 3 크고 평평한 플라스틱 상자 </td><td></td><td></td><td> 하이브 리다이 제이션 및 항체 단계에 필요한 </td></tr><tr><td> 좋은 브러쉬 </td><td></td><td></td><td> 왁스 리본을 나눠 도움말 </td></tr><tr><td> 마이크로톰 </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> 셀프 클리닝 드라이 진공 시스템 </td><td> 웨일스 사람 </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> 따뜻한 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 가열 블록 </td><td></td><td></td><td> 60 ° C와 85 ° C에서 필요</td></tr><tr><td> 58-60시 인큐베이터 ° C </td><td> 어부 </td><td></td><td> 용융 Paraplast과 단계 </td></tr><tr><td> 55 ° C와 37 ° C에 대한 오븐이나 물을 욕조 </td><td> 어부 </td><td></td><td> 온도 사이의 빠른 변화로 인해 두 필요 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 퓸 후드 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants

몇 십년의 게놈 연구의 발전과 함께, 식물 생물학은 유전자 발현의 대규모 양적 분석을 제시 수많은 연구를 볼 수 있습니다. Microarray 및 차세대 시퀀싱 접근 방식은, 발달, 생리학 및 스트레스 반응 과정을 조사 epigenetic과 작은 RNA 경로를 해부하다, 그리고 1-3 대규모 유전자 규제 네트워크를 구축하는 데 사용되고있다. 이 기술이 대규모 유전자 세트의 동시 분석을 용이하게하는 동안, 그들은 일반적으로 유전자 발현 변화의 매우 제한된 spatiotemporal 해상도를 제공합니다. 이 제한은 부분적으로 lasermicrodissection 또는 4-7를 정렬 형광 - 활성 세포와 함께 방법을 사용하거나 프로 파일링하여 극복할 수 있습니다. 그러나, 완전히 유전자의 생물 학적 역할을 이해하기 위해, 세포 해상도로 표현의 spatiotemporal 패턴에 대한 지식이 필수적입니다. 특히, 개발 또는 환경 STI의 효과를 공부하면muli 및 돌연변이 유전자의 표현 패턴의 상세한 분석이 필수적이 될 수 있습니다. 특정 세포 유형에 표현의 손실 또는 이득과 관련된 경우 예를 들어, 핵심 규제 유전자의 표현 수준에 미묘한 양적 차이가 극적인 phenotypes 발생할 수 있습니다. 여러 가지 방법은 정기적으로 유전자 발현 패턴의 세부 심사에 사용됩니다. 하나는 유전자 변형 기자 라인의 분석을 통해이다. 여러 개의 유전자를 분석하거나 변화에 완강히 저항하는 식물에서 작업할 때 이러한 분석은, 그러나, 시간이 많이 걸리는 될 수 있습니다. 또한, transgene 표현식 패턴이 내생 유전자의를 모방 수 있도록 독립적인 검증은 일반적으로 필요합니다. 현장 하이브 리다이 제이션에 Immunohistochemical 단백질 지방화 또는 mRNA는 세포와 조직 내에서 유전자 발현의 직접적인 시각화에 대한 비교적 빠른 대안을 제시한다. 후자는 쉽게 U 수있는 독특한 장점을 가지고관심의 유전자에 SED. 원위치 하이브 리다이 제이션에 관심의 유전자의 시험 관내 전사에 의해 얻은 프로브 표시 안티 - 감각의 RNA와 하이브리드화하여 세포 표적 mRNAs의 탐지 수 있습니다. 여기 우리는 높은 감도와 구체적인 식물의 유전자 표현의 현장 지방화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 paraformaldehyde에 고정, 파라핀 - 임베디드 섹션, 조직학 우수 보존을주고 단백질 감지 및 알칼리성 인산 가수 분해 효소 - colorimetric 반응에 의해 시각 아르 발굴 - 분류 프로브와 함께 사용하기위한 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 성공적으로 식물 종의 다양한 조직의 숫자에 적용되었으며, mRNAs뿐만 아니라 작은 RNAs 8-14의 표현을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

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In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

<em&gt; 현장에서</em여기에 설명된&gt; 하이브 리다이 제이션 프로토콜은 높은 민감도와 특이성과 세포 수준에서 mRNA 작은 RNA 표현의 직접적인 지역화 가능합니다. 절차는, 파라핀 - 임베디드 식물 조직 섹션에 최적화된 식물과 조직의 다양한 적용, 10 일 이내에 완료될 수 있습니다.

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Research

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형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...