Name: in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00
Duration: 12 min 15 s
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Pesquisa no laboratório de MT é suportado por concessões do National Science Foundation (DBI-0820610-1022102 e IOS) e do Departamento de NY da Saúde (NYSTEM-C024308). CM recebeu bolsas de pós-doutorado do Ministério espanhol da Educação e Ciência (2007-0937) e da Fundação Rafael del Pino, Espanha.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O método de hibridização in situ descrito aqui permite a visualização direta do padrão de expressão espaço-temporal de qualquer gene de interesse, com resolução de celular grande, de alta sensibilidade e especificidade. O protocolo não permite uma comparação quantitativa dos níveis de expressão entre os genes. No entanto, de alta sensibilidade do método e da resolução pode revelar gradientes de expressão de genes dentro de um tecido de 8, 18, ​​que não é possível com a maioria dos outros métodos de análise de expressão gênica. O protocolo inclui várias etapas, que podem fazer de resolução de problemas problemático. Os passos mais críticos do protocolo são a fixação do tecido e da seleção e rotulagem da sonda. Tecidos mal infiltrado e sondas com incorporação DIG baixa renderá sinais muito fracos que podem ser difíceis de detectar acima de fundo. Para cada novo gene de interesse, é aconselhável tentar algumas sondas distintas derivadas de difealugar regiões da transcrição. Ocasionalmente, duas ou três sondas de segmentação diferentes regiões menores do gene pode precisar ser combinados para obter um sinal forte e hibridização específica. Além disso, as condições de hibridização, como a temperatura ea composição do tampão de hibridação, pode ser otimizado para cada gene ou tecido para diminuir ou aumentar o rigor de hibridização. Também a etapa de tratamento protease é uma variável e pode ser alterado para adaptar o protocolo para diferentes espécies de plantas ou para a detecção de transcritos com abundância muito baixa. A inclusão de ambas as sondas de controlo positivo e negativo será útil na identificação de pontos problemáticos do protocolo. O procedimento é otimizado para parafina cortes de tecidos vegetais, mas com pequenas modificações podem ser usados ​​também para todo o monte de hibridização in situ. Embora amplamente utilizados em animais de pesquisa 19, montar toda a hibridização in situ será limited de tecidos vegetais que podem ser facilmente infiltrado, como embriões, raízes ou jovens tecidos meristemáticos 20,21. O protocolo também pode ser facilmente modificado para detectar simultaneamente dois mRNAs distintos ou localizar transcrições junto proteínas 15,22,23. Finalmente, é possível estender a aplicação deste método para a visualização de pequenas padrões de expressão do RNA em plantas. padrões de expressão de miRNA foram determinados utilizando este protocolo em ambos milho e Arabidopsis 8,14. Mais recentemente, o em sondas transcritos in vitro foram substituídos por comercialmente disponíveis DIG marcado bloqueado ácidos nucleicos (LNA) sondas oligo que aumentam a sensibilidade do sinal 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Produto </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Observações </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4 oz </td><td> Pescador </td><td> 23-244-256 </td><td> Tolueno baseado em 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Pescador </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Além disso tecido Path Paraplast </td><td> Pescador </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + membrana de nylon Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT; 40 U / mL </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase-Free DNase; 1 U / mL </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG marcado Controle RNA </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA mix rotulagem </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 polimerase RNA 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> RNA polimerase T3 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA polimerase 1000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> dissolver em glicerol 50% pH8.0 Tris 100mM </td></tr><tr><td> Bloqueio de reagente </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Calor de até 70 ° C em tampão TBS </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenina-AP, fragmentos Fab de ovelha 150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP solução estoque </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> mini-rotação rápida Colunas RNA </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA de E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida deionizada </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Protease de Streptomyces griseus Tipo XIV </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Diluir em água MilliQ e pré-digerir 4 horas a 37 ° C </td></tr><tr><td> Trietanolamina </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Diluída em água, leve ao pH8.0 com HCl </td></tr><tr><td> Anidrido acético </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran sal sulfato de sódio a partir de Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Sulfato de Dextran deve ser aquecido a 80 ° C para dissolver. </td></tr><tr><td> Solução Denhardt de Concentrado de 50x </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina Y sal dissódico </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Dissolver em etanol 96-100% até saturada </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol absoluto prova 200 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fenol / clorofórmio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base de Dados de moldes </td><td> Eletrônicos Microsocpy Ciência </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Anéis de incorporação </td><td> Pescador </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml descartáveis ​​frascos de cintilação, com tampas </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda-on-plus slides </td><td> Pescador </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Óculos de cobrir Micro 24x50 milímetros </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman 3 milímetros de papel </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Três pratos de vidro e um staiporta-lâminas de aço NLES </td><td> Eletrônicos Microsocpy Ciência </td><td> 71420-25 </td><td> Duas de vidro côncavo são necessárias para o tratamento histoclear eo último é utilizado para o tratamento de anidrido acético </td></tr><tr><td> 18 recipientes de plástico limpos </td><td> Eletrônicos Microsocpy Ciência </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ou 3 grandes plana caixas de plástico com tampa selável </td><td></td><td></td><td> necessários para as etapas de hibridização e de anticorpos </td></tr><tr><td> Pincéis finos </td><td></td><td></td><td> Ajuda distribuindo fitas de cera </td></tr><tr><td> Micrótomo </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Auto-limpeza a seco sistema de vácuo </td><td> Ludibriar </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Deslize mais quentes </td><td> Pescador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bloco de aquecimento </td><td></td><td></td><td> necessários a 60 ° C e 85 ° C</td></tr><tr><td> Incubadora a 58-60 ° C </td><td> Pescador </td><td></td><td> Para as etapas com Paraplast fundido </td></tr><tr><td> Fornos ou banhos de água de 55 ° C e 37 ° C </td><td> Pescador </td><td></td><td> Precisa de dois, devido à mudança rápida entre as temperaturas </td></tr><tr><td> Centrifugação (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coifa </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants

Com os avanços na pesquisa genômica da década passada, biologia vegetal tem visto apresentando numerosos estudos em larga escala as análises quantitativas de expressão gênica. Microarray e abordagens sequenciamento de última geração estão sendo usados ​​para investigar processos de resposta de desenvolvimento, fisiológicos e stress, dissecar as vias epigenéticas e pequenos RNA, e construir redes de grande gene regulador 1-3. Embora essas técnicas facilitam a análise simultânea de conjuntos de genes de grande porte, que normalmente fornecem uma resolução muito limitado espaço-temporal das mudanças de expressão gênica. Esta limitação pode ser superada parcialmente usando perfis método em conjunto com lasermicrodissection ou fluorescência-ativado celular classificação 4-7. No entanto, para compreender plenamente o papel biológico de um gene, o conhecimento de seu padrão espaço-temporal de expressão em uma resolução celular é essencial. Particularmente, quando se estuda o desenvolvimento ou os efeitos de sti ambientaismuli e mutantes podem a análise detalhada do padrão de expressão de um gene tornam-se essenciais. Por exemplo, sutis diferenças quantitativas nos níveis de expressão de genes-chave de regulamentação pode levar a fenótipos dramática quando associada com a perda ou ganho de expressão, em tipos específicos de células. Vários métodos são usados ​​rotineiramente para a análise detalhada dos padrões de expressão gênica. Uma delas é através da análise das linhas de repórter transgênicos. Tal análise pode, no entanto, tornar-se demorado quando se analisa genes múltiplos ou trabalhando em plantas recalcitrantes a transformação. Além disso, uma validação independente para garantir que o padrão de expressão do transgene imita a do gene endógeno é normalmente necessária. Localização de proteínas imuno-histoquímica ou hibridização in situ mRNA apresentar alternativas relativamente rápido para a visualização direta da expressão do gene nas células e tecidos. Este último tem a vantagem que pode ser facilmente used em qualquer gene de interesse. A hibridização in situ permite a detecção de mRNAs em células-alvo por hibridização com um marcado sentido anti-RNA sonda obtida por transcrição in vitro do gene de interesse. Aqui nós descrevemos um protocolo para a localização em situ da expressão gênica em plantas, que é altamente sensibilidade e específicos. Ele é otimizado para uso com paraformaldeído fixos, parafina seções, que dão excelente preservação da histologia, e sondas DIG-rotulados que são visualizados através da imuno-detecção e fosfatase alcalina-reação colorimétrica. Este protocolo tem sido aplicado com sucesso em uma série de tecidos a partir de uma ampla gama de espécies de plantas, e pode ser usado para analisar a expressão de mRNAs, assim como pequenos RNAs 8-14.

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In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

O<em&gt; In situ</em&gt; Protocolo de hibridização descrita aqui permite a localização direta de mRNA e expressão do RNA pequeno no nível celular com alta sensibilidade e especificidade. O procedimento é otimizado para parafina cortes de tecidos de plantas, é aplicável a uma grande variedade de plantas e tecidos, e pode ser concluído no prazo de 10 dias.

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

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