Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

نقدم الشكر الخاص لكيم لينو، وستيف جوزمان ساتيارثي Ujit للمساعدة التقنية خلال تطوير هذا الأسلوب. تشكيله مايرون هوثورن، Spengel ريتشارد، وروبرتو روخاس الدوائر المستخدمة هنا وقدمت الكثير في أمس الحاجة إليها المساعدة التقنية. والجدير بالذكر أن إنتاج روبرتو روخاس الشكل 4. كما نشكر للمشورة سكوت فريزر لا تقدر بثمن قبل وضع الفحص الكيميائي من أعلاه. وأيد هذا العمل من قبل جزئيا على درجة 5S06GM048680-13-NIH-MBRS لMEdB وجائزة من، CSU برنامج الدراسات العليا نورثريدج دعم الرسالة إلى CW.

1. يوم 1: عزل أنابيب الجذع العصبية للثقافة بين عشية وضحاها على coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض لمدة 56 ساعة فرخ في 38 ° C. إزالة البيض من الحضانة، أقل ما يقال لهم رش مع الايثانول 70٪، ومن ثم تسمح لهم لتجف. كسر البيض في فتح علبة زجاجية معقم?...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

إجراء البحوث الكيميائي على البلدان المساهمة الصافية الجذع وقد ثبت تحديا لسلسلة من الأسباب. البلدان المساهمة الصافية الجذع تشكل الخلايا الجذعية غير المتجانسة التي من شأنها أن تفرق السكان إذا مثقف على المدى الطويل، وبالتالي، يجب الحصول على الجذع من البلدان المساهمة ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> أوميغا العلمية </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين الحل </td><td> أوميغا العلمية </td><td> PS-20 </td><td> 100X الأسهم تركيز </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> أوميغا العلمية </td><td> GS-60 </td><td> 100X الأسهم تركيز </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> أوميغا العلمية </td><td> FB-11 </td><td> # 105247 الكثير (أو آخر يمكن مقارنتها) </td></tr><tr><td> تعديل زيجموند غرفة </td><td> المنزل الذي أدلى </td><td> N / A </td><td> حجم الخزان: ~ 160 ميكرولتر عصام؛ لمواصفات إضافية، انظر الشكل. (4) وبروتوكول إضافي تلفيق </td></tr><tr><td> خلية ثقافة طبق </td><tد&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 × 10 مم </td></tr><tr><td> فبرونيكتين </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> هيأهم للأوراق 10X من تمييع 1 ملغ FN في 1 مل O 2 H و 9 مل DMEM </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> الصياد </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned؛ 22 × 22 مم </td></tr><tr><td> L15 المتوسطة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> الفازلين </td><td> وسائل الراحة </td><td> 011110794642 </td><td> 100٪ </td></tr><tr><td> الطرد المركزي أنبوب </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 مل </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> نظم الخلايا </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X الأسهم تركيز </td></tr><tr><td> محقنة </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> إبرة </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 غ × 1.5 بوصة </td></tr><tr><td> الكسا فلور 488-الغلوبولين المناعي </td><td> أناnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> الأسهم هو 2 ملغ / مل و 7 الشامات صبغ / خلد الغلوبولين المناعي </td></tr><tr><td> تشريح الملقط </td><td> FST </td><td> منوعات. </td><td> دومون # 5 أو 55؛ التوالي الرؤوس؛ الفولاذ المقاوم للصدأ أو التيتانيوم </td></tr><tr><td> التنغستن الإبرة </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> المنزل الذي أدلى؛ ضعت في حامل دبوس </td></tr><tr><td> الملقط حادة </td><td> تيمان </td><td> 160-18 </td><td> تستخدم لنقل الأجنة إلى وقارع الأجراس من صفار البيض </td></tr></tbody></table> بروتوكول الإضافي: التصنيع لإحدى دوائر المحكمة زيجموند معدلة يرجى الرجوع إلى الشكل 4 كمرجع لبروتوكول أدناه: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء ورقة سميكة من الاكريليك 3/16 &quot;مصقول (4.45 مم سماكة الفعلي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جدول رأى، قطع الفراغات غرفة كبيرة الحجم للأبعاد الخام من 33،25 مم × 64،57 ملم. هذا يسمح 3،175 مم للمواد اضافية بالقطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين فارغة على غرفة السادسحد ذاتها. مع آلة الطحن ومم 6.35 (1/4 &quot;) نهاية بت طاحونة، والانتهاء من الآلات الجانبين من الغرفة لأبعادها بالضبط: 30.07 مم × 61،39 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فارغة الغرفة على آلة طحن وتحديد موقع مركز فارغة على طول X على حد سواء ومحاور ذ مع مكتشف حافة، ثم الصفر موقع المركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على غرفة ارتفاع (Z-المحور) من خلال لمس بت طاحونة حد للالسطح العلوي وصفر في الارتفاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مم 3.91 (0.154 &quot;) نهاية بت طاحونة، ويقابل بت 3،03 مم على طول محور س (اتجاه إيجابي) لخزان الأولى. بيغن بالقطع في غرفة على عمق 2،84 ملم بينما تتحرك على طول المحور ص ( الاتجاه الإيجابي) إلى 7.62 مم (0.300 &quot;)، ثم تعبر إلى 7.62 ملم (0.300&quot;) في الاتجاه (سلبي) مقابل طول الخزان كاملة من 15.24 ملم (0.600 &quot;). تعويض قليلا إلى 3.03 مم (0.119 &quot;) على طول محور س (اتجاه سلبي) وكرر نفس العملية للخزان الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع دائرة على حافتهوحفر حفرة باستخدام مم 1.09 (0.043 بوصة) على قمة الحفر نهاية كل خزان (4 الكل) الذي يربط نهاية الخزان إلى جانب قاعة لتحميل المتوسطة خلال التجريب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع في غرفة البئر بماء دافئ وصابون للمساعدة على إزالة أي ملوثات كيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع وشطف جيدا في غرفة مزدوجة الماء المقطر لإزالة أي الصابون. الدوائر هي الآن جاهزة للاستخدام كما هو موضح أعلاه. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

الخلايا العصبية قمة (البلدان المساهمة الصافية) هي عابرة السكان من الخلايا موجودة في الفقاريات التي التنمية الهجرة من الأنبوب العصبي الظهري (NT) بعد خضوعه ل1،2 الانتقال الظهارية-الوسيطة. بعد EMT، البلدان المساهمة الصافية الهجرة مسافات كبيرة على طول مسارات النمطية حتى وصولها الى اهدافها. البلدان المساهمة الصافية تفرق في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الخلايا الصباغية، والخلايا أليفة الكروم 1-3. قدرة البلدان المساهمة الصافية لتصل إلى مواقعها والتعرف على الهدف الصحيح هو التأسيسية لتشكيل المناسب لجميع الهياكل التي تحتوي على الجذع NCC المستمدة من المكونات 3. توضيح آليات التوجيه لجذع NCC الهجرة كان ذلك مسألة ذات أهمية كبيرة. وقد أظهرت العديد من الجزيئات لتوجيه NCC الهجرة 4. على سبيل المثال، من المعروف أن البلدان المساهمة الصافية الجذع صده العظة التوجيه السلبية مثل Semaphorin، Ephrin، والشق يغاندس 5-8. ومع ذلك، لاحتى مؤخرا أي من البلدان المساهمة الصافية chemoattractants الجذع تم تحديد 9. التقليدية في النهج المختبر لدراسة السلوك الكيميائي للخلايا ملتصقة تعمل بشكل أفضل مع الخلايا متجانس خلد، توزيع، ولكنها أكثر صعوبة لتطبيق بعض الثقافات الخلايا الجذعية الأولية التي تفتقر في البداية توزيع متجانس وتفرق بسرعة (مثل البلدان المساهمة الصافية). نهج واحد لتحقيق التجانس توزيع البلدان المساهمة الصافية للدراسات الجذع الكيميائي هو عزل البلدان المساهمة الصافية الجذع من المرحلة الابتدائية الثقافات يزدرع NT، ثم ارفع وreplate لها أن تكون ما يقرب من 100٪ متموجة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب الطلاء كميات كبيرة من الوقت والجهد ليزدرع الخلايا بما فيه الكفاية، قاس، وتوزيع البلدان المساهمة الصافية الجذع بطريقة تختلف عن تلك الموجودة في الجسم الحي في ظروف. هنا، ونحن التقرير نهجا في المختبر قادر على تقييم ردود المهاجرة الكيميائي وغيرها من البلدان المساهمة الصافية دون الجذع requirinالجا متجانسة التوزيع الخلية. هذه التقنية تستخدم الوقت الفاصل بين التصوير الأولية، رابط الجأش البلدان المساهمة الصافية الجذع داخل غرفة زيجموند المعدلة (يوصف غرفة زيجموند القياسية في أماكن أخرى 10). من خلال تعريض البلدان المساهمة الصافية في محيط الجذع من الثقافة إلى أن الانحدار chemotactant هو عمودي على اتجاهها الطبيعي توقع، يمكن الكشف عن تغييرات في الاستقطاب الناجم عن الهجرة التدرج chemotactant التطبيقية. هذه التقنية غير مكلفة، تتطلب زراعة من إإكسبلنتس NT اثنين فقط في علاج تكرار، يتجنب قاسية رفع الخلية (مثل trypsinization)، ويترك البلدان المساهمة الصافية في الجذع توزيع أكثر مماثلة لفي ظروف الجسم الحي، التخفيضات مقدار الوقت بين explantation والتجريب (مما يقلل من خطر المحتمل تمايز)، ويسمح الوقت الفاصل بين تقييم الخصائص المهاجرة عديدة.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة من الخلايا explanted (خلايا الجذع قمة العصبية). هذه الطريقة غير مكلفة، لطيف، وقادرة على التمييز الكيميائي من كلا تنشيط كيميائي والتأثيرات الأخرى على الاستقطاب المهاجرة مثل تلك المشتقة من خلية خلية التفاعلات داخل الجذع العصبية الأولية قمة الثقافة الخلية.

تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

إنتاج استخراج الجنين الفرخ لزراعة الخلايا الجذعية العصبية الفئران كريست

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

العصبية تشكيل مستعمرة الفحص الخلوي : إن الفحص تميز بحسن نية الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا العصبية السلف

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

شارك في تحليل بنية الدماغ والدالة باستخدام الرنين المغناطيسي الوظيفي وانتشارها المرجحة التصوير

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...