Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

We geven speciale dank aan Lino Kim, Steve Guzman en Ujit Satyarthi voor technische bijstand bij de ontwikkeling van deze methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel, en Roberto Rojas bewerkt de kamers hier gebruikt en op voorwaarde dat de broodnodige technische bijstand. Met name Roberto Rojas geproduceerd Figuur 4. We zijn ook dankbaar voor waardevolle adviezen Scott Fraser voorafgaand aan de ontwikkeling van de hierboven chemotaxis assay. Dit werk werd mede ondersteund door een NIH-MBR SCORE-5S06GM048680-13 om Medb en door een prijs van de CSU, Northridge Graduate Thesis Support Program aan CW.

1. Dag 1: Isolatie van de romp neurale buizen voor overnachting cultuur op dekglaasjes <ol><li> Incubeer chick eieren voor 56 uur bij 38 ° C. De eieren Verwijderen uit incubatie, licht besproeien ze met 70% Ethanol en laat ze drogen. Breek de eieren open in een UV-gesteriliseerde glazen draaiplateau. </li><li> Uittreksel elk embryo uit de dooier en plaats deze in kuiken Ringer&#39;s. Doe dit door eerst snijden rond zijn bloed eilanden met gebogen schaar, vandaar met stompe pincet, pak het embryo door de extra-embryon...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Het uitvoeren van chemotaxis onderzoek op stam NCC heeft bewezen een uitdaging voor een aantal redenen. Trunk NCC&#39;s vormen een heterogene stamcel populatie die zal differentiëren als gekweekte lange termijn, daarom romp NCC&#39;s moet worden verkregen van de primaire explantatie van de stam-niveau NT. Conventionele methoden om de chemotactische respons van homogeen verdeeld celpopulaties in vitro bestuderen zijn moeilijk te testen op stam NCC omdat ze eerst dient cellen geïsoleerd en homogeen opnieuw uitg...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Wetenschappelijke </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline streptomycine-oplossing </td><td> Omega Wetenschappelijke </td><td> PS-20 </td><td> 100X Stock Concentratie </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Omega Wetenschappelijke </td><td> GS-60 </td><td> 100X Stock Concentratie </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Omega Wetenschappelijke </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (of een ander dat vergelijkbaar is) </td></tr><tr><td> Gewijzigd Zigmond kamer </td><td> Huisgemaakte </td><td> N / A </td><td> Reservoir volume: ~ 160 ul ea, voor aanvullende specificaties, zie Fig. 4 en de aanvullende fabricage protocol </td></tr><tr><td> Celkweekschaal </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectine </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X Stock voorbereid door verdunning 1 mg FN in 1 ml H2O en 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Visser </td><td> 12-548 B- </td><td> Voorgereinigde; 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vaseline </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Centrifugebuis </td><td> Biologix </td><td> 10-9.152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Cell Systems </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X Stock Concentratie </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Naald </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 inch </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Iknvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Stock is 2 mg / ml, 7 mol kleurstof / mol IgM </td></tr><tr><td> Ontleden tang </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 of 55; rechte tip, roestvrij staal of titanium </td></tr><tr><td> Tungsten Naald </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Home made, geplaatst in een penhouder </td></tr><tr><td> Blunt Forceps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Gebruikt voor het overbrengen embryo&#39;s Ringer&#39;s uit eidooier </td></tr></tbody></table> Aanvullende Protocol: Fabricage van een Modified Zigmond Kamer Raadpleeg figuur 4 als referentie voor het protocol hieronder: <ol><li> Koop een blad van 3/16 &quot;dik gepolijst acryl (4,45 mm werkelijke dikte). </li><li> Met behulp van een tafel zag, snijd kamer blanks extra groot om de ruwe afmetingen van 33,25 mm x 64,57 mm. Hiermee 3,175 mm extra materiaal voor de bewerking. </li><li> Stel de kamer leeg op een vise. Met een freesmachine en een 6,35 mm (1/4 &quot;) frees bit, nabewerken van de zijkanten van de kamer om de exacte afmetingen: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Plaats de kamer leeg op de freesmachine en zoek het midden van de lege langs zowel de x-en y-assen met een kantentaster, dan nul de locatie in het centrum. </li><li> Verwerven kamerhoogte (z-as) door op de frees bit aan het bovenoppervlak en de hoogte nul. </li><li> Met een 3,91 mm (0,154 &quot;) frees bit te verhelpen bit 3,03 mm langs de x-as (positieve richting) voor het eerste reservoir. Begin bewerking in de kamer tot een diepte van 2,84 mm, terwijl die langs de y-as ( positieve richting) tot 7,62 mm (0,300 &quot;) en doorlopen tot 7,62 mm (0,300&quot;) in de andere (negatieve) richting een volledige reservoir lengte van 15,24 mm (0,600 &quot;). Offset de bit tot 3,03 mm (0,119 &quot;) langs de x-as (negatieve richting) en herhaal hetzelfde proces voor het tweede reservoir. </li><li> Plaats de kamer op de randen boor een gat van 1,09 mm (0,043 inch) boortje op het einde van elk reservoir (4 totaal) dat het einde van het reservoir aangesloten op de zijde van de kamer voor het laden medium tijdens proeven. </li><li> Goed Geniet van de kamer in een warm sopje te helpen elke chemische verontreinigingen te verwijderen. </li><li> Geniet en goed spoelen de kamer in dubbel gedestilleerd water om alle zeep te verwijderen. De kamers zijn nu klaar voor gebruik zoals hierboven beschreven. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Neurale cellen (NCC) een voorbijgaande populatie van cellen in de ontwikkeling van vertebraten die uit de dorsale neurale buis (NT) NZ na het ondergaan van een epitheliale-mesenchymale transitie 1,2. Na EMT, NCC&#39;s migreren grote afstanden langs stereotype paden totdat ze hun doelstellingen. NCC&#39;s differentiëren tot een breed scala aan celtypes waaronder neuronen, glia, melanocyten, en chromaffin cellen 1-3. Het vermogen van NCC&#39;s te bereiken en herkennen hun juiste doellocaties is fundamenteel voor de juiste vorming van alle structuren die trunk NCC-afgeleide componenten 3. Het ophelderen van de mechanismen van begeleiding voor romp NCC migratie is dan ook een kwestie van grote betekenis. Talrijke moleculen zijn gebleken NCC migratie 4 leiden. Zo worden trunk NCC&#39;s bekend te worden afgestoten door negatieve begeleiding signalen zoals Semaphorin, Efrine, en Slit liganden 5-8. Echter niettot voor kort geen chemoattractanten van stam NCC geïdentificeerd 9. Conventionele benaderingen in vitro bestuderen van het gedrag van chemotactische hechtende cellen werken beste geïmmortaliseerd, homogeen verdeeld cellen, maar moeilijker om voor bepaalde primaire stamcelculturen die aanvankelijk missen een homogene verdeling en snel differentiëren (bijvoorbeeld NCC). Een benadering voor de verdeling van stam NCC voor chemotaxis studies meng is trunk NCC isoleren van primaire NT explantaat culturen til en replate ze bijna 100% confluent. Echter, deze plating aanpak vereist aanzienlijke hoeveelheden tijd en moeite om voldoende cellen explanteren, is hard, en distribueert romp nationale centra voor valsemunterij op een ongelijke wijze als in in vivo omstandigheden. Hier rapporteren we een in vitro methode die in staat is chemotaxis en andere migrerende reacties van stam NCC evalueren zonder requirinGA homogene cel distributie. Deze techniek maakt gebruik van time-lapse imaging van de primaire, romp NCC onverstoord in een gemodificeerde Zigmond kamer (een standaard Zigmond kamer wordt elders 10 beschreven). Door belichting stam NCC aan de omtrek van de cultuur een chemotactant gradiënt loodrecht op hun voorspelde natuurlijke richtinggevoeligheid kunnen veranderingen in trekkende polariteit opgewekt door de toegepaste gradiënt chemotactant worden gedetecteerd. Deze techniek is goedkoop, vereist het kweken van twee NT explantaten per herhaling behandeling vermijdt harde cel heffen (zoals trypsine), bladeren trunk NCC in een soortgelijke verdeling in vivo omstandigheden, vermindert de hoeveelheid tijd tussen explantatie en experimenten (waardoor waarschijnlijk het risico van differentiatie), en maakt time-lapse evaluatie van talrijke trekkende eigenschappen.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproduceerbare Mouse heupzenuw Crush en de daaropvolgende beoordeling van Regeneratie door Whole Mount Muscle Analyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Co-analyse van hersenstructuur en functie met behulp van fMRI en Diffusie-gewogen beeldvorming

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...