Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
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Wir geben besonderen Dank an Lino Kim, Steve Guzman und Ujit Satyarthi für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel und Roberto Rojas bearbeitet die Kammern verwendet hier und dringend benötigte technische Unterstützung. Bemerkenswert ist, produziert Roberto Rojas Abbildung 4. Wir sind auch dankbar für wertvolle Ratschläge Scott Fraser vor der Entwicklung der oben genannten Chemotaxis Assay. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 bis MEDB und durch eine Auszeichnung von der CSU, Northridge Diplomarbeit Support Program CW unterstützt.

Ein. Tag 1: Isolierung von Stamm neuronalen Rohre für Übernacht-Kultur auf Deckgläsern <ol><li> Inkubieren chick Eier für 56 h bei 38 ° C. Entfernen Sie die Eier aus der Inkubation, leicht besprühen sie mit 70% Ethanol und dann trocknen lassen. Die Eier öffnen sich in einem UV-sterilisiert Glasschale. </li><li> Extrahieren Sie jede Embryo aus Dotter und legen Sie sie in chick Ringer. Tun Sie dies, indem zuerst um seine Blutinseln mit gebogenen Schere, dann mit stumpfen Pinzette, wählen Sie die Embryos von sein...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Dirigieren Chemotaxis Forschung am Stamm NCCs erwiesen Herausforderung für eine Reihe von Gründen. Trunk NCCs sind eine heterogene Stammzellen Bevölkerung unterscheiden, ob kultivierten langfristigen wird, daher trunk NCCs aus primären Explantation des Stamm-Ebene NT eingeholt werden muss. Herkömmliche Verfahren, die chemotaktische Reaktion von homogen verteilt Zellpopulationen in vitro zu untersuchen sind schwierig auf Trunk NCCs testen, da sie zuerst erforderlich, dass Zellen getrennt und homogen wiederp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Scientific </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin-Lösung </td><td> Omega Scientific </td><td> PS-20 </td><td> 100X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Omega Scientific </td><td> GS-60 </td><td> 100X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Omega Scientific </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (oder eine andere, die vergleichbar ist) </td></tr><tr><td> Modified Zigmond Kammer </td><td> Hausgemachte </td><td> N / A </td><td> Behältervolumen: ~ 160 ul ea, für zusätzliche Spezifikationen, siehe Abb. 4 und die ergänzende Herstellung Protokoll </td></tr><tr><td> Zellkulturschale </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X Lager vorbereitet durch Verdünnen von 1 mg FN in 1 ml H 2 O und 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fischer </td><td> 12-548-B </td><td> Vorgereinigt; 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 Medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Cell Systems </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nadel </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 Zoll </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Ichnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Stock ist 2 mg / ml; 7 Mol Farbstoff / Mol IgM </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 oder 55; geraden gekippt; Edelstahl oder Titan </td></tr><tr><td> Tungsten Needle </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Hausgemachte; platziert in einem Stifthalter </td></tr><tr><td> Blunt Forceps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Wird für die Übertragung Embryonen Ringer aus Eigelb </td></tr></tbody></table> Supplemental Protokoll: Herstellung eines Modified Zigmond Kammer Bitte beachten Sie 4 als Referenz für das Protokoll in der folgenden Abbildung: <ol><li> Erwerben Sie ein Blatt 3/16 &quot;dick poliert Acryl (4,45 mm tatsächliche Dicke). </li><li> Mit einer Tischkreissäge, schneiden Kammer Rohlinge überdimensioniert, um den groben Abmessungen von 33,25 mm x 64,57 mm. Dies ermöglicht 3,175 mm zusätzliches Material für die Bearbeitung. </li><li> Die Kammer leer auf einer vise. Mit einer Fräsmaschine und einer 6,35 mm (1/4 &quot;) end mill bit, Fertigbearbeitung die Seiten der Kammer, um ihre genauen Abmessungen: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Positionieren Sie die Kammer leer auf der Fräsmaschine und suchen Sie die Mitte des Rohlings entlang der x-und y-Achse mit einem Kantentaster, dann Null das Stadtzentrum. </li><li> Erwerben die Kammer Höhe (z-Achse) durch Berühren des Schaftfräsers Bit auf der oberen Fläche und die Höhe Null. </li><li> Verwendung einer 3,91 mm (0,154 &quot;) Schaftfräser Bit, das Bit-Offset 3,03 mm entlang der x-Achse (positive Richtung) für das erste Reservoir. Begin Bearbeitung in die Kammer bis zu einer Tiefe von 2,84 mm während der Bewegung entlang der y-Achse ( positive Richtung) bis 7,62 mm (0,300) &quot;) und dann zu 7,62 mm (0,300 durchqueren&quot; in der entgegengesetzten (negativen) Richtung bis zu einem vollständigen Reservoir Länge von 15,24 mm (0,600 &quot;). Offset das Bit auf 3,03 mm (0,119 &quot;) entlang der x-Achse (negative Richtung) und wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Reservoir. </li><li> Positionieren Sie die Kammer an ihrem Randund Bohren eines Loches mit einem 1,09 mm (0,043 Zoll) Bohrmeißel am Ende eines jeden Behälters (4 total), das das Ende des Reservoirs verbindet zu der Seite der Kammer für das Laden Medium während Experimentieren. </li><li> Weichen Sie die Kammer auch in warmem Seifenwasser zu helfen, entfernen Sie keine chemischen Verunreinigungen. </li><li> Spülen Sie die Kammer auch in doppelt destilliertem Wasser keine Seife entfernen. Die Kammern sind jetzt einsatzbereit wie oben beschrieben. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Neuralleistenzellen (NCC) ist eine transiente Population von Zellen, die in Entwicklung von Wirbeltieren, dass aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern nach Durchlaufen eines epithelial-mesenchymale Transition 1,2. Nach EMT, migrieren NCCs große Entfernungen entlang stereotypes Wege, bis sie ihre Ziele zu erreichen. NCCs differenzieren sich in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Melanozyten und Chromaffinzellen 1-3. Die Fähigkeit von NCCs zu erreichen und erkennen ihre richtigen Zielregionen für die entsprechende Ausbildung aller Strukturen mit trunk NCC-abgeleiteten Komponenten 3 grundlegend. Aufklärung der Mechanismen von Leitlinien für Trunk NCC Migration hat deshalb eine Angelegenheit von großer Bedeutung. Zahlreiche Moleküle nachgewiesen, dass NCC Migration 4 führen. Beispielsweise werden Trunk NCCs bekanntermaßen von negativen Führung Zeitgeber wie Semaphorin, Ephrin und Slit Liganden 5-8 abgestoßen werden. Allerdings sind nichtbis vor kurzem keine Lockstoffe des Rumpfes NCCs identifiziert worden 9. Herkömmliche Ansätze zur in vitro Untersuchung der chemotaktischen Verhalten von adhärenten Zellen funktionieren am besten mit immortalisierten, homogen verteilt Zellen, sind jedoch schwieriger zu bestimmten primären Stammzellkulturen die zunächst fehlt eine homogene Verteilung und rasch zu unterscheiden (wie NCCs) anzuwenden. Ein Ansatz, um die Verteilung der Stamm NCCs für Chemotaxisstudien homogenisieren ist die Trunk NCCs aus primären NT Explantatkulturen isolieren, dann heben und replate ihnen zu fast 100% konfluent. Dies erfordert jedoch plating Ansatz erhebliche Mengen an Zeit und Mühe, um genügend Zellen Explantation, ist hart und vertreibt trunk NCCs in einem ungleichen Weise wie in in vivo-Bedingungen gefunden. Hier berichten wir über eine in vitro Ansatz, der in der Lage, Chemotaxis und andere wandernde Reaktionen des Rumpfes NCCs ohne requirin bewerten istga homogene Zellverteilung. Diese Technik nutzt Zeitraffer-Aufnahmen von primären, unbeirrt trunk NCCs in einem modifizierten Zigmond Kammer (ein Standard Zigmond Kammer wird an anderer Stelle 10 beschrieben). Durch Belichten Trunk NCCs am Umfang der Kultur auf eine chemotactant Gradienten, die senkrecht zu ihrer vorhergesagten natürliche Richtung, können Veränderungen in wandernden Polarität durch die angelegte chemotactant Gradienten induzierte detektiert werden. Diese Technik ist kostengünstig, erfordert das Züchten von nur zwei NT je Wiederholung Explantate Behandlung vermeidet rauen Zelle Anheben (wie Trypsinisierung) verlässt Trunk NCCs in eine ähnliche Verteilung in vivo-Bedingungen, verkürzt sich die Zeitspanne zwischen Explantation und Experimente (was wahrscheinlich verringert das Risiko der Differenzierung), und ermöglicht Zeitraffer Auswertung zahlreicher wandernden Merkmale.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Herstellung von Hühnerembryo-Extrakt für die Kultivierung von Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Co-Analyse von Hirnstruktur und-funktion mittels fMRT und Diffusionsgewichtete Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...