Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

אנחנו נותנים תודה מיוחדת ללינוי קים, סטיב גוזמן וUjit Satyarthi לסיוע טכני במהלך הפיתוח של שיטה זו. מיירון הות&#39;ורן, ריצ&#39;רד Spengel, ורוברטו רוחאס מכונת התאים משמשים כאן וספקו סיוע טכני נחוץ. יש לציין, רוברטו רוחאס הופק איור 4. אנחנו גם אסירת תודה על העצות היקרות הערך של סקוט פרייזר לקראת הפיתוח של assay chemotaxis לעיל. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי SCORE-5S06GM048680-13-NIH MBRS לMEdB ופרס מהמחלקה לזיהוי הפלילי, תכנית תמיכת תזת בוגר Northridge לCW.

1. יום 1: בידוד של צינורות גזע עצביים לתרבות לילה על coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת ביצי חומוס ל56 שעות ב 38 ° C. הסר את הביצים מדגירה, מרסס אותם במתינות עם אתנול 70%, ולאחר מכן לאפשר להם לייבוש. שובר את הביצים לרווחה אל תוך מגש זכוכית UV-מעוקר. </li>...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

מחקר chemotaxis על NCCs הגזע הוכיח מאתגר עבור סדרה של סיבות. NCCs Trunk מהווה אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע שתתמיין ואם תרבותי לטווח ארוך, ולכן יש לקבל NCCs הגזע מexplantation העיקרי של NT תא מטען ברמה. שיטות מקובלות ללימוד תגובת chemotactic של אוכלוסיות תאים חולקו homogenously במבחנה קשות לבדו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> אומגה מדעית </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון סטרפטומיצין פניצילין </td><td> אומגה מדעית </td><td> נ.ב.-20 </td><td> ריכוז המניות 100X </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> אומגה מדעית </td><td> GS-60 </td><td> ריכוז המניות 100X </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> אומגה מדעית </td><td> FB-11 </td><td> לוט # 105247 (או אחר שניתן להשוות) </td></tr><tr><td> שינוי Zigmond קאמרי </td><td> תוצרת הבית </td><td> N / </td><td> נפח מאגר: ~ 160 ea μl; למפרטים נוספים, ראה איור. 4 ופרוטוקול המשלים ייצור </td></tr><tr><td> צלחת תרבית תאים </td><tד&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 10 מ&quot;מ x </td></tr><tr><td> פיברונקטין </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> מניית 10X prepped על ידי דילול 1 מ&quot;ג FN במיליליטר H 2 O 1 ו המ&quot;ל DMEM 9 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> דיג </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned; 22 x 22 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> L15 בינוני </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> וזלין </td><td> מנחם </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> צינור צנטריפוגה </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> מערכות סלולריות </td><td> 4Z0-850 </td><td> ריכוז המניות 10X </td></tr><tr><td> מזרק </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מחט </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1.5 פנימה </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 488-IgM </td><td> אניnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> מניות הן 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל; IgM 7 שומות צבע / שומה </td></tr><tr><td> מלקחיים מבתרים </td><td> FST </td><td> שונה. </td><td> דומון # 5 או 55; נירוסטה או טיטניום, ישר הטתה </td></tr><tr><td> מחט טונגסטן </td><td> N / </td><td> N / </td><td> עשה בית; להציב בעל סיכה </td></tr><tr><td> מלקחי בלאנט </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> משמש להעברת עוברים לצלצול של מחלמון הביצה </td></tr></tbody></table> פרוטוקול משלים: המצאה של שינוי Zigmond קאמרי אנא עיין באיור 4 כנקודת התייחסות לפרוטוקול שלהלן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש גיליון &quot;אקריליק המלוטש העבה 3/16 (עובי 4.45 מ&quot;מ בפועל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטבלה ראה, לחתוך חסר קאמרי גדול מדי לממדים הגסים של 33.25 מ&quot;מ x 64.57 מ&quot;מ. זה מאפשר חומר נוסף 3.175 מ&quot;מ לעיבוד שבבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה הריקה הקאמרי בvise. עם מכונת טחינה ו6.35 מ&quot;מ (1/4 &quot;) קצת טחנת הסוף, עיבוד שבבי לסיים את הצדדים של התא למידות המדויקות שלהם: 30.07 מ&quot;מ x 61.39 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הריק הקאמרי במכונת הטחינה ולאתר את המרכז הריק לאורך שני צירי x ו-y עם מאתר קצה, ואז לאפס את מיקום המרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את גובה התא (ציר Z-) על ידי נגיעה קצת טחנת הסוף למשטח העליון ולאפס את הגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש קצת טחנת סוף 3.91 מ&quot;מ (0.154 &quot;), קוזז 3.03 המ&quot;מ קצת לאורך ציר X (כיוון חיובי) למאגר הראשון. בגין עיבוד לתוך החדר לעומק של 2.84 מ&quot;מ ואילו נע לאורך ציר y ( כיוון חיובי) ל7.62 מ&quot;מ (0.300 &quot;) ולאחר מכן לעבור ל7.62 מ&quot;מ (0.300&quot;) בכיוון ההפוך (שלילי) לאורך מאגר מלא של 15.24 מ&quot;מ (0.600 &quot;). לקזז קצת ל3.03 מ&quot;מ (0.119 &quot;) לאורך ציר X (כיוון שלילי) ולחזור על אותו התהליך למאגר השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את החדר בקצה שלהולקדוח חור באמצעות 1.09 מ&quot;מ (0.043 אינץ&#39;) מקדח בסיומו של כל מאגר (4 סה&quot;כ) שמחבר את קצו של המאגר לצד של החדר לטעינה בינונית במהלך ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרה את החדר היטב במים חמים וסבון כדי לסייע להסיר את כל מזהמים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים ולשטוף היטב במי החדר מזוקקי פעמים כדי להסיר כל סבון. התאים מוכנים כעת לשימוש כמתואר לעיל. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

תאי רכס עצביים (NCCs) הם אוכלוסייה זמנית של תאים הנמצאים בפיתוח חוליות שלהגר מצינור העצבי הגבה (NT) לאחר שעבר 1,2 מעבר אפיתל-mesenchymal. בעקבות EMT, NCCs לנדוד מרחקים גדולים לאורך מסלולים סטריאוטיפיים עד שהם מגיעים ליעדיהם. NCCs להתמיין למגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאי עצב, גליה המלנוציטים, תאי 1-3 chromaffin. היכולת של NCCs להגיע ולהכיר מקומות היעד הנכונים שלהם היא יסוד להיווצרות המתאימה של כל המבנים המכילים תא מטען נגזר NCC-3 מרכיבים. הבהרת מנגנוני ההדרכה לגזע NCC הגירה הייתה אפוא עניין בעל חשיבות רבה. מולקולות רבות שהפגינו להדריך NCC הגירת 4. לדוגמה, NCCs גזע ידוע להיות דחוי על ידי רמזי הדרכה שליליים כגון Semaphorin, Ephrin, וligands חריץ 5-8. עם זאת, לאעד לאחרונה היה לי chemoattractants של NCCs מטען זוהה 9. גישות קונבנציונליות במבחנה ללימוד התנהגות chemotactic של תאי חסיד עבודה הטובה ביותר עם ​​תאים הנציחו, homogenously מופץ, אך מאתגרים יותר לפנות לתרבויות מסוימות העיקריות בתאי גזע שתחילה חסרות הפצה הומוגני ומהירות להבדיל (כגון NCCs). גישה אחת לומוגני חלוקת NCCs מטען ללימודי chemotaxis היא לבודד NCCs גזע מתרבויות explant NT העיקריות, ואז להרים וreplate להיות כמעט 100% confluent. עם זאת, גישה זו דורשת ציפוי כמויות ניכרות של זמן ומאמץ כדי explant מספיק תאים, היא קשה, ומפיצת NCCs מטען באופן שונה מזו שנמצא בתנאי vivo. כאן, אנו מדווחים גישה במבחנה כי הוא מסוגל להעריך את התגובות נודדות Chemotaxis ואחרות של NCCs מטען ללא requirinGA חלוקת תא הומוגנית. טכניקה זו מנצלת הדמיה זמן לשגות של ראשוני, ואינה נרתעת NCCs מטען בתוך modified Zigmond קאמרי (קאמרי Zigmond סטנדרטי מתואר במקום אחר 10). על ידי חשיפת NCCs מטען בפריפריה של התרבות לשיפוע chemotactant שניצבת ליווניות הטבעיות חזו, שינויים בקוטביות נודדת הנגרמים על ידי שיפוע chemotactant מיושם ניתן לאתר. טכניקה זו היא זולה, דורשת culturing של רק שני explants NT לטיפול לשכפל, נמנע מהרמת תא קשה (כגון trypsinization), משאיר NCCs מטען בהפצה דומה יותר לתנאי vivo, חותך את כמות הזמן בין explantation וניסויים (שסביר להניח מפחית את הסיכון לבידול), ומאפשר הערכת זמן לשגות של מאפיינים נודדים רבים.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

הפקה של חילוץ העובר צ&#39;יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

עכבר לשחזור Sciatic עצב קראש והערכה לאחר ההתחדשות של ניתוח הר שלם שריר

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

שיתוף ניתוח של מבנה המוח ותפקודו באמצעות fMRI ודיפוזיה משוקללת הדמיה

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...