Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
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Rendiamo grazie speciale a Lino Kim, Steve Guzman e Ujit Satyarthi per l&#39;assistenza tecnica durante lo sviluppo di questo metodo. Myron Hawthorne, Richard Spengel, e Roberto Rojas lavorati le camere utilizzate qui e ha fornito la necessaria assistenza tecnica. In particolare, Roberto Rojas prodotto Figura 4. Siamo anche grati per preziosi consigli prima dello sviluppo del test chemiotassi sopra Scott Fraser. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da un NIH-MBSR SCORE-5S06GM048680-13 a Medb e da un premio dalla, Programma CSU Northridge Supporto Tesi di Laurea su CW.

1. Giorno 1: Isolamento di tubi tronco neurali per la cultura durante la notte su vetrini <ol><li> Incubare le uova pulcino per 56 ore a 38 ° C. Togliere le uova da incubazione, leggermente spruzzateli con etanolo al 70%, e poi lasciarle asciugare. Rompete le uova si schiudono in un vassoio di vetro UV-sterilizzati. </li><li> Estrarre ogni embrione dal suo uovo e metterlo nella pulcino Ringer. A tale scopo, primo taglio circa le sue isole di sangue con le forbici curve, poi, con una pinza smussato, prendere l&#39;emb...

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	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Condurre ricerche sulla chemiotassi CNC tronco si è dimostrato difficile per una serie di ragioni. CNC Trunk costituiscono una eterogenea popolazione di cellule staminali che si differenziano, se coltivate a lungo termine, pertanto, CNC tronco devono essere ottenuti da espianto primario del tronco a livello di NT. I metodi convenzionali per studiare la risposta chemiotattica di popolazioni cellulari distribuiti omogeneamente in vitro sono difficili da testare su NCCs tronco dal loro primo richiedono che le cel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega scientifico </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina Streptomicina Soluzione </td><td> Omega scientifico </td><td> PS-20 </td><td> Archivio concentrazione 100X </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Omega scientifico </td><td> GS-60 </td><td> Archivio concentrazione 100X </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Omega scientifico </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (o un altro che è comparabile) </td></tr><tr><td> Modificata Zigmond camera </td><td> Fatto in casa </td><td> N / A </td><td> Capacità serbatoio: ~ 160 microlitri bis, per le altre specifiche, vedi fig. 4 e il protocollo di fabbricazione supplementare </td></tr><tr><td> Colture cellulari piatto </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> Stock 10x prepped diluendo 1 mg FN in 1 ml H 2 O e 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Pescatore </td><td> 12-548-B </td><td> Prefiltrata, 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 media </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vaselina </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Centrifuga tubo </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Sistemi cellulari </td><td> 4Z0-850 </td><td> Archivio concentrazione 10X </td></tr><tr><td> Siringa </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Ago </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 pollici </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Ionvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Foto è di 2 mg / ml; 7 moli colorante / mole IgM </td></tr><tr><td> Pinze per dissezione </td><td> FST </td><td> Varie. </td><td> Dumont # 5 o 55; dritto a punta, in acciaio inox o in titanio </td></tr><tr><td> Tungsten Needle </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Fatta in casa, posto in un supporto del perno </td></tr><tr><td> Blunt Pinze </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Usato per il trasferimento di embrioni di Ringer da tuorlo d&#39;uovo </td></tr></tbody></table> Protocollo supplementare: Realizzazione di un Zigmond Modified Camera Fare riferimento alla Figura 4 come riferimento per il protocollo di seguito: <ol><li> Acquistare un foglio di 3/16 &quot;di spessore acrilico lucido (4,45 mm di spessore effettivo). </li><li> Utilizzando una sega, tagliare gli spazi della camera di grandi dimensioni per le dimensioni approssimative di 33,25 millimetri x 64,57 millimetri. Questo permette 3,175 mm materiale supplementare per la lavorazione. </li><li> Impostare la camera vuota su un VISE. Con una fresatrice e un 6,35 mm (1/4 &quot;) mulino bit fine, lavorazioni di finitura delle pareti della camera di loro esatte dimensioni: 30.07 mm x 61,39 millimetri. </li><li> Posizionare la camera di vuoto della macchina di fresatura e individuare il centro del bianco lungo gli assi xey con un tastatore di spigoli, poi azzerare la posizione centrale. </li><li> Acquisire l&#39;altezza della camera (asse z) toccando il bit fresa alla superficie superiore e azzerare l&#39;altezza. </li><li> Utilizzando un 3,91 millimetri (0,154 &quot;) mulino bit fine, il bit di offset 3,03 millimetri lungo l&#39;asse x (direzione positiva) per il primo serbatoio. Iniziare lavorazione nella camera ad una profondità di 2,84 mm mentre si muove lungo l&#39;asse y ( direzione positiva) a 7,62 mm (0,300 &quot;) e poi attraversare a 7,62 mm (0,300&quot;) in senso opposto (negativo) fino ad un serbatoio di lunghezza completa di 15,24 mm (0,600 &quot;). Il bit di offset di 3,03 millimetri (0,119 &quot;) lungo l&#39;asse x (direzione negativa) e ripetere la stessa procedura per il secondo serbatoio. </li><li> Posizionare la camera sul suo bordoe praticare un foro con un 1,09 millimetri (0,043 pollici) punta sull&#39;estremità di ciascun serbatoio (4 totale) che collega l&#39;estremità del serbatoio al lato della camera per il carico medio durante la sperimentazione. </li><li> Mettere a bagno la camera bene in acqua tiepida e sapone per rimuovere eventuali contaminanti chimici. </li><li> Immergere e sciacquare la camera ben in acqua bidistillata per rimuovere qualsiasi sapone. Le camere sono ora pronti per l&#39;uso come descritto sopra. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Cellule della cresta neurale (CNC) sono una popolazione transitoria di cellule presenti nello sviluppo dei vertebrati che emigrano dal tubo neurale dorsale (NT), dopo aver subito un epitelio-mesenchimale 1,2 transizione. A seguito di EMT, CNC migrare grandi distanze lungo percorsi stereotipati fino a raggiungere i loro obiettivi. CNC differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule tra cui i neuroni, glia, melanociti e cellule cromaffini 1-3. La capacità di CNC di raggiungere e riconoscere i loro percorsi di destinazione corretta è fondamentale per la formazione adeguata di tutte le strutture contenenti tronco NCC-derivato componenti 3. Chiarire i meccanismi di orientamento per la linea esterna NCC la migrazione è stata quindi una questione di grande importanza. Numerose molecole hanno dimostrato di guidare la migrazione NCC 4. Per esempio, CNC tronco sono noti per essere respinti da stimoli negativi come orientamento semaforina, efrina, e leganti a fessura 5-8. Tuttavia, nonfino a poco tempo eventuali fattori chemiotattici di CNC tronco stati identificati 9. Convenzionale negli approcci in vitro per lo studio del comportamento chemiotattico di cellule aderenti funzionare al meglio con le cellule immortalizzate, omogeneamente distribuiti, ma sono più difficili da applicare alle colture primarie di cellule staminali determinate che inizialmente non hanno una distribuzione omogenea e differenziano rapidamente (ad esempio CNC). Un approccio per omogeneizzare la distribuzione di CNC tronco per gli studi di chemiotassi è quello di isolare CNC tronco da colture primarie di espianti NT, quindi sollevare e replate loro di essere quasi al 100% confluenti. Tuttavia, questo approccio placcatura richiede notevoli quantità di tempo e fatica per espiantare numero sufficiente di cellule, è dura, e distribuisce CNC tronco in modo dissimile da quella che si trova nelle condizioni in vivo. Qui, segnaliamo un approccio in vitro che è in grado di valutare le risposte migratori chemiotassi e altre NCCs tronco senza requiringa distribuzione omogenea delle cellule. Questa tecnica utilizza time-lapse imaging di primario, imperturbabile CNC tronco all&#39;interno di una Zigmond modificato camera (una camera standard di Zigmond sono descritti in un 10). Esponendo NCCs tronco alla periferia della coltura di un gradiente chemotactant che è perpendicolare alla loro direzionalità predetto naturale, alterazioni polarità migratori indotti dal gradiente chemotactant applicata può essere rilevato. Questa tecnica è poco costoso, richiede la coltura di due soli espianti NT per trattamento replica, evita sollevamento dura cellule (come tripsinizzazione), lascia NCCs tronco in una distribuzione più simile a condizioni in vivo, riduce la quantità di tempo tra espianto e sperimentazione (probabile che riduce il rischio di differenziazione), e permette time-lapse valutazione di numerose caratteristiche migratori.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Un approccio per analizzare la migrazione delle cellule espiantate (cellule della cresta neurale tronco) è descritto. Questo metodo è poco costoso, delicato, e in grado di distinguere la chemiotassi sia da chemochinesi e altre influenze sulla polarità dei migratori come quelli derivati ​​da interazioni cellula-cellula all&#39;interno della principale coltura cresta neurale delle cellule del tronco.

Analisi della migrazione cresta neurale cellulare Trunk con un Modified Zigmond Assay Camera

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Produzione di estratto di Chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

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Neuroscienze

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