Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
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我々は、このメソッドの開発中に技術的な支援のためにリノキム、スティーヴ·グスマンとUjit Satyarthiに特別な感謝を与える。マイロン·ホーソーン、リチャードSpengel、ロベルト·ロハスは、ここで使用室を機械加工し、待望の技術支援を提供した。特筆すべきは、ロベルト·ロハスは、図4を産生した。我々はまた、上記の走化性アッセイの開発に先立っスコットフレイザーの貴重なアドバイスに感謝しています。本研究の一部はMEDBにNIHのMBRをのSCORE-5S06GM048680-13でサポートされているとCSUノースリッジ校大学院学位論文支援プログラムからCWに受賞をされました。

1。 1日目：カバースリップ上で一晩培養した培養液のトランク神経管の分離<ol><li> 38℃56時間、ニワトリの卵をインキュベート℃でインキュベーションから卵を取り出し、穏やかに70％エタノールを用いてそれらをスプレーして、それらを乾燥させます。紫外線滅菌ガラストレイに開いた卵を割る。 </li><li>その卵黄から各胚を解凍して、ひよこリンゲルに配置します。湾曲したハサミでその...

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	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

トランクNCCSで走化性研究を実施することの理由のシリーズのためにやりがいがあると判明しました。トランクNCCSは、長期培養した場合と区別されます異種の幹細胞集団を構成しているので、トランクNCCSはトランクレベルのNTのプライマリ植から取得する必要があります。彼らが最初に細胞が単離され、均質に走化性チャンバー（例えば、ボイデンチャンバー12）に再播種されている?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液</td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> PS-20 </td><td> 100Xストック濃度</td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> GS-60 </td><td> 100Xストック濃度</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>オメガ·サイエンティフィック</td><td> FB-11 </td><td>ロット＃105247（または匹敵する別） </td></tr><tr><td>変性Zigmond室</td><td>ホームメイドの</td><td> N / A </td><td>タンク容量：〜160μlのEA、詳細な仕様については、図を参照してください。 4と補足製造プロトコル</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><tD&gt;デンヴィル</td><td> T6040 </td><td> 40×10ミリメートル</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10Xストックは1ミリリットルH 2 Oおよび9ミリリットルDMEM中で1mgのFNを希釈することにより、整形処理</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> 12から548-B </td><td>予備洗浄し、22×22ミリメートル</td></tr><tr><td> L15培地</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>快適さ</td><td> 011110794642 </td><td> 100パーセント</td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td> Biologix </td><td> 10から9152 </td><td> 15ミリリットル</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>電池システム</td><td> 4Z0-850 </td><td> 10Xストック濃度</td></tr><tr><td>注射器</td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td>針</td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G X 1.5インチ</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488-IgMの</td><td>私nvitrogen </td><td> A21042 </td><td>株式は2 mg / mlである。7モル染料/モルのIgM </td></tr><tr><td>解剖用ピンセット</td><td> FST </td><td>その他。 </td><td>デュモン＃5または55;ストレート先端、ステンレス鋼やチタン</td></tr><tr><td>タングステン針</td><td> N / A </td><td> N / A </td><td>自家製、ピンホルダーに配置</td></tr><tr><td>ブラント鉗子</td><td>ティーマン</td><td> 160から18 </td><td>卵黄からリンゲル液に胚を転送するために使用</td></tr></tbody></table>補足議定書：修正Zigmondチャンバーの作製下記のプロトコルのための基準として、図4を参照してください： <ol><li> 3月16日 &quot;厚磨かれたアクリル（4.45ミリメートル実際の厚さ）のシートを購入します。 </li><li>テーブルソーを使用して、33.25ミリメートルX 64.57ミリメートルの大まかな寸法に特大のチャンバーのブランクを切った。これは、加工用の3.175ミリメートル余分な材料が可能になります。 </li><li> VIのチャンバーを空白にして設定するSE。 30.07ミリメートルX 61.39ミリメートル：フライス盤と6.35ミリメートル（1/4 &quot;）エンドミルビット、仕上げ加工、それらの正確な寸法にチャンバーの側面を持つ。 </li><li>フライス盤でチャンバーのブランクを置き、エッジファインダを使って、x軸とy軸の両方に沿ってブランクの中心を見つけ、中心位置がゼロ。 </li><li>上面にエンドミルビットに触れることによりチャンバーの高さ（Z軸）を取得し、高さをゼロにします。 </li><li> 3.91ミリメートル（0.154 &quot;）エンドミルビットを使用して、最初の貯水池のx軸（正方向）に沿ってビット3.03ミリメートルをオフセットします。y軸に沿って移動しながら（2.84ミリメ​​ートルの深さまでチャンバー内に機械加工を開始7.62ミリメートル（0.300 &quot;）、そして7.62ミリメートル（0.300にトラバース&quot; 15.24ミリメートル（0.600 &quot;）の完全な貯水池長に反対（負）の方向）に正の方向）。 x軸（負の方向）に沿って3.03ミリメートル（0.119 &quot;）ビットをオフセットと第二貯水池の同じプロセスを繰り返します。 </li><li>その縁でチャンバーを置き·実験中に培地をロードするためのチャンバの側面に貯水池の端を接続する各リザーバー（計4個）の端に1.09ミリメートル（0.043インチ）のドリルビットを使って穴を開けます。 </li><li>任意の化学汚染物質を除去するために暖かい石鹸水でよくチャンバーを浸す。 </li><li>どんな石鹸を除去するために蒸留水でよくチャンバーを浸して洗ってください。チャンバーは現在上記のように使用する準備が整いました。 </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

神経堤細胞は（NCCS）上皮間葉移行1,2を経て神経管背側（NT）から移住している脊椎動物の発生中に存在する細胞の一時的な集団である。彼らは目標に到達するまで、EMTに続いて、NCCSは常の経路に沿って長い距離を移行します。 NCCSは、ニューロン、グリア細胞、メラノサイト、および1-3クロマフィン細胞を含む細胞型の広大な配列に分化する。それらの適切なターゲットの場所に到達し、認識するNCCSの能力はトランク部品3 NCC由来を含むすべての構造の適切な形成のための基礎的です。トランクNCCの移行のための指導のメカニズムを解明すること、したがって非常に重要な問題となっています。多数の分子がNCCの移行4を導くことが実証されている。たとえば、トランクNCCSは、セマフォリン、エフリン、スリットリガンド5月8日のような負の指導の手がかりではじかれることが知られている。ただし、いない最近までトランクNCCS任意の化学誘引物質は、9同定されている。 付着細胞の走化性行動の研究にvitroアプローチで、従来は不死化、均一に分布細胞で最適に動作しますが、最初は均一な分布を欠いており、急速に分化する（例えばNCCSなど）特定の主要な幹細胞培養物に適用することがより困難である。走化性研究のためにトランクNCCSの分布を均一化する一つのアプローチは、持ち上げると、それらはほぼ100％コンフルエントになるようにreplate次に、プライマリNTの外植培養からトランクNCCSを単離することである。しかし、このメッキのアプローチは、時間と労力のかなりの量が十分な細胞を植する必要が過酷であり、 インビボ条件下で見つかっに異なる方法でトランクNCCSを配布しています。 ここでは、requirinずにトランクNCCSの走化性および他の渡り鳥の応答を評価することがin vitroでのアプローチを報告GA均質な細胞分布。この手法は、修正Zigmondチャンバー（標準Zigmond室は別の場所で10記述されています）内部トランクNCCS乱れのない、原発のタイムラプスイメージングを利用しています。彼らの自然な方向性予測に垂直であるchemotactantグラデーションに文化の周縁部にトランクNCCSを公開することにより、適用されたchemotactant勾配によって誘起される渡り鳥極性の変化を検出することができる。この手法は、レプリケート処理あたり2つだけのNT外植片の培養を必要とする過酷な細胞リフティングを（例えばトリプシン処理など）を回避し、植と実験の間の時間が削減され、in vivo条件下でより同様の分布にトランクNCCSを残し、安価である（おそらく差別のリスクを軽減している）、および多数の渡り鳥の特性の経時的評価を可能にします。

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

植された細胞（幹神経堤細胞）の移行を解析するアプローチが説明されています。この方法は、安価な優しい、そのような主要なトランク神経堤細胞培養内細胞間相互作用に由来するもののような渡り鳥の極性にケモキネシスと他の影響の両方からの走化性を区別することができる。

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

fMRIと拡散強調画像を用いた脳の構造と機能の同時分析

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...