Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
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우리는이 방법의 개발 기간 동안 기술 지원 리노 김, 스티브 구즈만과 Ujit Satyarthi에 특별한 감사를드립니다. 마이런 호손, 리차드 Spengel, 그리고 로베르토 로자 스 여기에 사용 된 방을 가공하고 꼭 필요한 기술 지원을 제공했습니다. 특히, 로베르토 로자 스는 그림 4를 만들었습니다. 우리는 또한 위의 chemotaxis 분석의 발전에 이전 스콧 프레이저 귀중한 조언 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 NIH-MBRS 평가 점수 - 5S06GM048680-13 MEdB에 의해 CW의 CSU, 왕국 대학원 논문 지원 프로그램에서 수상에 의해 지원되었다.

1. 1 일 : coverslips에 밤 문화의 트렁크 신경 튜브의 분리 <ol><li> 38 56 H에 대한 여자의 알을 품어 ° C.는 부화에서 알을 제거 다소 70 %의 에탄올과 함께 물을 뿌리 한 후이를 건조 할 수 있습니다. UV-소독 유리 트레이에 열려있는 알을 해봐. </li><li> 의 난황에서 각 배아를 추출하고 여자는 벨소리의에 배치합니다. 곡선 가위로 그 피 섬 주변의 제 1 절삭하여이 작업을 수행 한 후, 무딘 집게와, 그 extraem...

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	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

트렁크 NCCs에 chemotaxis 조사를 실시하는 것은 이유 시리즈 도전 입증되었습니다. 따라서 트렁크 NCCs은 트렁크 수준 NT의 주 explantation에서 구할 수해야하며 간선 NCCs는 교양 장기 경우 차별화 이기종 줄기 세포 인구를 구성합니다. 체외에서 homogenously 배포 세포 인구의 chemotactic 응답을 공부하는 종래의 방법은 먼저 세포가 고립과 chemotaxis 챔버 (예를 들어, Boyden 챔버 12)의 replated homogenou...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 오메가 과학 </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 솔루션 </td><td> 오메가 과학 </td><td> PS-20 </td><td> 100X 주식 농도 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> 오메가 과학 </td><td> GS-60 </td><td> 100X 주식 농도 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 오메가 과학 </td><td> FB-11 </td><td> 롯 # 105247 (또는 비교가 또) </td></tr><tr><td> 수정 Zigmond 챔버 </td><td> 홈 만든 </td><td> N / A </td><td> 저수지 볼륨 : ~ 160 μl EA, 추가 사양, 그림을 참조하십시오. 4 보충 제조 프로토콜 </td></tr><tr><td> 세포 배양 접시 </td><tD&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 X 10mm </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X 증권은 1 ML H 2 O 9 ML DMEM에 1 밀리그램 FN을 diluting하여 준비 </td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned, 22 X 22mm </td></tr><tr><td> L15 매체 </td><td> 열 과학 </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> 석유 젤리 </td><td> 불우 </td><td> 011110794642 </td><td> 백퍼센트 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 관 </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ML </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 전지 시스템 </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X 주식 농도 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G X 1.5 인치 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 488-IgM </td><td> 나는nvitrogen </td><td> A21042 </td><td> 주식은 2 밀리그램 / ML이다; 7 첩자 염료 / 사마귀 IgM </td></tr><tr><td> 해부 집게 </td><td> FST </td><td> 기타. </td><td> 뒤몽 # 5 또는 55, 직선 날붙이, 스테인리스 스틸 또는 티타늄 </td></tr><tr><td> 텅스텐 니들 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 집에서 만든, 핀 홀더에 배치 </td></tr><tr><td> 부근 집게 </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> 계란 노른자에서 벨소리 집으로 배아를 전송하는 데 사용 </td></tr></tbody></table> 보충 프로토콜 : 수정일 Zigmond 상공 회의소의 제작 아래의 프로토콜에 대한 참고 자료로 4 그림 참조하십시오 : <ol><li> 16분의 3 &quot;두께의 광택 아크릴 (4.45 mm 실제 두께)의 시트를 구입하십시오. </li><li> 테이블을 사용하면 33.25 mm X 64.57 mm의 거친 크기에 대형 챔버 공백을 잘라, 보았다. 이 가공 3.175 mm 추가 자료를 수 있습니다. </li><li> 바이올렛에 챔버를 비워 설정SE. 30.07 mm X 61.39 mm : 밀링 머신 및 6.35 mm (1 / 4 &quot;) 엔드 밀 비트, 마무리 가공 정확한 크기로 챔버의 측면이 있습니다. </li><li> 밀링 머신에 챔버를 비워 놓고 x와 가장자리 찾기와 Y 축 모두 함께 빈의 중심을 찾으 한 후 중앙 위치를 제로. </li><li> 상단 표면에 엔드 밀 비트를 터치하면 챔버 높이 (Z 축)을 취득하고 높이를 제로. </li><li> 3.91 mm (0.154 &quot;) 엔드 밀 비트를 사용하여 첫 번째 저수지의 X-축 (긍정적 인 방향)을 따라 비트 3.03 mm 오프셋. y 축 따라 이동하는 동안 (2.84 mm의 깊이에 챔버로 가공을 시작합니다 7.62 mm (0.300까지) 방향으로 긍정적 인 15.24 mm (0.600 &quot;)의 전체 저수지의 길이에 반대 (음수) 방향으로)&quot;를 선택한 다음)과 7.62 mm (0.300으로 통과 &quot;. X-축 (부정적인 방향)을 따라 3.03 mm (0.119 &quot;)에 비트 오프셋 두 번째 저수지에 대해 동일한 과정을 반복합니다. </li><li> 의 가장자리에있는 챔버를 배치합니다그리고 실험 기간 동안 미디어를로드하는 챔버의 측면에 저수지의 끝을 연결하는 각 저수지 (4 총)의 말에 1.09 mm (0.043 인치) 드릴 비트를 사용하여 구멍을 뚫는다. </li><li> 어떤 화학 오염 물질을 제거하는 데 도움 따뜻한 비눗물에 잘 챔버를 적시 게. </li><li> 모든 비누를 제거 두 번 증류수에 잘 챔버를 적시하고 헹굼. 방은 이제 위에서 설명한대로 사용할 수 있습니다. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

신경 크레스트 세포는 (NCCs) 상피 - 중간 엽 전이 1,2를 진행 한 후 등쪽의 신경 튜브 (NT)에서 이민을하는 척추 동물의 개발에 존재하는 세포의 과도 인구입니다. 자신의 목표에 도달 할 때까지 EMT 따라 NCCs는 stereotypic 경로를 따라 큰 거리를 마이그레이션. NCCs는 뉴런, glia, melanocytes, 그리고 1-3 chromaffin 세포를 포함한 세포 유형의 광대 한 배열로 차별화. 자신의 적절한 타겟 위치에 도달하고 인식 NCCs의 능력 트렁크 구성 요소를 세 NCC-파생를 포함하는 모든 구조의 적절한 형성을위한 기초입니다. 트렁크 NCC 마이그레이션에 대한 지침의 메커니즘을 Elucidating하는 것은 큰 의미를 갖는 일이었다. 많은 분자 NCC 마이그레이션 4 안내하는 입증되었습니다. 예를 들어, 트렁크 NCCs는 이러한 Semaphorin, Ephrin, 그리고 슬릿 리간드 5-8 등의 제외지도 단서에 의해 거부 될 것으로 알려져 있습니다. 그러나,하지최근 트렁크 NCCs 9 식별 된 모든 chemoattractants이 때까지. 자기편 세포의 chemotactic 동작을 공부에 체외 접근 방법에서 기존는 불후의, homogenously 배포 세포를 가지고 가장 적합한하지만, 처음 균일 분포를 부족 빠르게 (예 : NCCs 등) 차별화 특정 기본 줄기 세포 문화에 적용 할 더 도전합니다. chemotaxis 연구 트렁크 NCCs의 분포를 균질화하는 한 접근 방식이 기본 NT의 explant 문화에서 트렁크 NCCs를 분리하는 것입니다 다음, 리프트하고는 거의 100 % 합류 할 replate. 그러나,이 도금 방식은 시간과 충분한 세포를 explant 노력의 상당한 양을 필요로 거칠고이며, 생체 조건에서 발견 할 수있는 이종 방식으로 트렁크 NCCs를 배포합니다. 여기, 우리는 requirin없이 트렁크 NCCs의 chemotaxis 및 다른 철새 반응을 평가 할 수 있습니다에서 체외 접근 방식을보고균일 한 세포 분포를 GA. 이 기술은, 기본의 시간 경과 영상을 이용하여 수정 Zigmond 챔버 (표준 Zigmond 챔버가 다른 10 설명) 내부 트렁크 NCCs을 교란되지 않은. 자신의 예측 자연 방향에 수직 인 chemotactant 그라디언트로 문화의 주변에서 트렁크 NCCs를 노출하여 적용 chemotactant 기울기에 의해 유도 철새 극성에 변경이 감지 할 수 있습니다. 이 기술은 저렴 복제 치료를 당 두 개의 NT의 explants의 배양을 필요로, 거친 셀 리프팅 (예 : trypsinization 등) 방지 생체 조건에 유사한 배포판에 트렁크 NCCs을 떠난, explantation과 실험 사이의 시간의 양 다운 컷 (이 가능성이 차별화의 위험을 감소), 그리고 수많은 철새 특성을 시간 경과 평가를 할 수 있습니다.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

explanted 전지 (트렁크 신경 크레스트 세포)의 마이그레이션을 분석 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은, 저렴한 부드러운, 그리고 차 트렁크 신경 크레스트 세포 배양에서 세포 세포의 상호 작용에서 파생 된 것과 같은 철새 극성에 모두 chemokinesis 및 기타 영향의 chemotaxis를 구별 할 수 있습니다.

수정 Zigmond 회의소 분석을 사용하여 트렁크 신경 크레스트 세포 마이그레이션 분석

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

연구

신경과학

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

세포 어세를 형성 신경 콜로니 : 신경 전구 세포로부터 타고난 신경 줄기 세포를 차별 어세이

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

fMRI 및 확산 - 가중 영상을 사용하여 뇌의 구조와 기능의 공동 분석

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...