Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
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Damos graças especiais para Lino Kim, Steve Guzman e Satyarthi Ujit de assistência técnica durante o desenvolvimento deste método. Myron Hawthorne, Richard Spengel, e Roberto Rojas usinado as câmaras usadas aqui e desde muito necessária assistência técnica. Notavelmente, Roberto Rojas produzido Figura 4. Estamos também gratos conselhos inestimáveis ​​Scott Fraser antes do desenvolvimento do ensaio de quimiotaxia acima. Este trabalho foi parcialmente financiado por um SCORE-5S06GM048680-13 NIH-MBRS para Medb e por um prêmio do, Northridge CSU de Pós-Graduação Programa de Apoio à Tese de CW.

1. Dia 1: O isolamento de tubos de tronco neurais para a cultura durante a noite em lamelas <ol><li> Incubar os ovos de pintainho para 56 h a 38 ° C. Retirar os ovos de incubação, levemente pulverizá-los com etanol a 70%, e, em seguida, permitir que sequem. Quebre os ovos abertos em uma bandeja de vidro UV-esterilizado. </li><li> Extraia cada embrião a partir da sua gema e colocá-lo no pinto de Ringer. Faça isso primeiro corte em torno de suas ilhas de sangue com tesoura curva, em seguida, com uma pinça sem co...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Realização de pesquisas sobre a quimiotaxia NCCs tronco provou um desafio para uma série de razões. NCCs tronco constituem uma população heterogénea de células estaminais que se diferenciam de cultura de longo prazo, por isso, NCCs tronco deve ser obtido a partir de explante primário do tronco NT-nível. Os métodos convencionais para estudar a resposta quimiotáctica de forma homogénea as populações de células in vitro são distribuídos difícil de testar em NCCs tronco desde que eles exigem que ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Científico </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Solução penicilina estreptomicina </td><td> Omega Científico </td><td> PS-20 </td><td> Concentração da 100X </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Omega Científico </td><td> GS-60 </td><td> Concentração da 100X </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Omega Científico </td><td> FB-11 </td><td> Lote # 105247 (ou outro que é comparável) </td></tr><tr><td> Modificado Zigmond câmara </td><td> Home made </td><td> N / A </td><td> Volume do reservatório: ~ ea 160 ul, para especificações adicionais, ver fig. 4 e o protocolo de fabricação suplementar </td></tr><tr><td> Placa de cultura de células </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> Banco 10X preparado por diluição de 1 mg em 1 ml de FN H 2 O e 9 ml de DMEM </td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Pescador </td><td> 12-548 B- </td><td> Previamente limpas, 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 médio </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vaselina </td><td> Conforta </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Tubo de centrífuga </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Sistemas celulares </td><td> 4Z0-850 </td><td> Concentração da 10X </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Agulha </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 pol </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Eunvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Estoque é de 2 mg / ml; 7 moles de corante / mole IgM </td></tr><tr><td> Pinças de dissecação </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont n º 5 ou 55; reta ponta, aço inox ou titânio </td></tr><tr><td> Agulha de tungstênio </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Home made; colocada num suporte pino </td></tr><tr><td> Fórceps Blunt </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Utilizado para transferência de embriões para Ringer de gema de ovo </td></tr></tbody></table> Suplementar Protocolo: Fabricação de um Zigmond Modificado Câmara Por favor consulte a figura 4, tal como uma referência para o protocolo abaixo: <ol><li> Comprar uma folha de 3/16 &quot;de acrílico grosso polido (4,45 mm de espessura real). </li><li> Usando uma serra de mesa, cortar espaços em branco da câmara de grandes dimensões com as dimensões aproximadas de 33,25 milímetros x 64,57 milímetros. Isso permite que 3,175 mm material extra para usinagem. </li><li> Defina a câmara em branco em uma vise. Com uma máquina de moagem e um de 6,35 mm (1/4 &quot;) bit fresa de topo, o acabamento dos lados da câmara, para as suas dimensões exactas: 30,07 milímetros x 61,39. </li><li> Posicione a câmara em branco na máquina de fresagem e localizar o centro do branco ao longo de ambos os eixos X e Y com um localizador de extremidade, então zero a posição do centro. </li><li> Adquirir a altura da câmara (eixo z), tocando o bit de fresa de topo com a superfície de topo e de zero a altura. </li><li> Usando um milímetro 3,91 (0,154 &quot;) bit fresa, compensar a 3,03 milímetros de bits ao longo do eixo x (sentido positivo) para o primeiro reservatório. Comece usinagem para dentro da câmara, até uma profundidade de 2,84 mm, enquanto se move ao longo do eixo y ( positivo sentido) a 7,62 mm (0,300 &quot;) e, em seguida, percorrem a 7,62 mm (0,300&quot;) na direcção (negativa), em frente a um comprimento de reservatório completo de 15,24 mm (0,600 &quot;). Compensar o bit a 3,03 mm (0,119 &quot;) ao longo do eixo x (sentido negativo) e repetir o processo para o segundo reservatório. </li><li> Posicione a câmara em sua bordae um furo com um milímetro 1,09 (0,043 polegadas) da broca na extremidade de cada reservatório (4 total) que liga a extremidade do reservatório para o lado da câmara de carga média durante a experimentação. </li><li> Mergulhe a câmara bem em água morna e sabão para ajudar a remover quaisquer contaminantes químicos. </li><li> Embeber e enxaguar a câmara poço de água duplamente destilada para remover qualquer sabão. As câmaras estão agora prontos a usar, tal como descrito acima. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Células da crista neural (CBCs) são uma população transitória de células presentes no desenvolvimento de vertebrados que emigram do tubo neural dorsal (NT) depois de passar por um 1,2 transição epitelial-mesenquimal. Após EMT, NCCs migrar grandes distâncias ao longo de caminhos estereotipados até que eles atinjam seus alvos. NCCs diferenciar em uma vasta gama de tipos de células incluindo neurónios, glia, melanócitos e células cromafins 1-3. A capacidade do NCC para chegar e reconhecer os seus locais de destino adequados é fundamental para a formação adequada de todas as estruturas que contêm NCC-tronco derivadas de componentes 3. Elucidar os mecanismos de orientação para o tronco NCC migração tem sido, portanto, uma questão de grande importância. Numerosas moléculas têm sido demonstrados para orientar a migração NCC 4. Por exemplo, os CBCs tronco são conhecidos por ser repelida por pistas de orientação negativas, tais como Semaforina, Efrina, e ligandos de fenda 5-8. No entanto, nãoaté recentemente tem quimioatractivos de NCCs tronco foram identificados 9. Convencional em abordagens in vitro para estudar o comportamento quimiotática de células aderentes trabalhar melhor com imortalizados, homogénea células distribuídas, mas são mais difíceis de aplicar a certas culturas primárias de células-tronco que, inicialmente, não possuem uma distribuição homogênea e rapidamente diferenciar (como NCC). Uma abordagem para homogeneizar a distribuição dos CBCs tronco para quimiotaxia estudos é isolar NCCs tronco a partir de culturas de explantes primários NT, em seguida, levantar e replate-los a ser quase 100% confluentes. No entanto, esta abordagem de revestimento requer quantidades substanciais de tempo e esforço para explantar células suficientes, é duro, e distribui NCCs tronco de um modo diferente daquele que foi encontrado em condições in vivo. Aqui, apresentamos uma abordagem in vitro que é capaz de avaliar quimiotaxia e outras respostas migratórios de tronco sem NCC requiringa distribuição celular homogênea. Esta técnica utiliza lapso de tempo de imagem de principal, imperturbável NCCs tronco dentro de uma câmara de Zigmond modificado (uma câmara Zigmond padrão é descrito em outra parte 10). Ao expor NCCs tronco na periferia da cultura a um gradiente chemotactant que é perpendicular à sua direccionalidade previu natural, alterações na polaridade migratório induzidas pelo gradiente chemotactant aplicada pode ser detectado. Esta técnica é pouco dispendioso, requer a cultura de apenas dois explantes por tratamento NT replicate, evita levantamento célula dura (tal como tripsinização), deixa NCCs tronco de uma distribuição mais semelhante a condições in vivo, reduz a quantidade de tempo entre o explante e experimentação (o que provavelmente reduz o risco de diferenciação), e permite a avaliação de lapso de tempo de numerosas características migratórias.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.

Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Neurociência

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Co-análise de estrutura e função cerebral usando ressonância magnética funcional e imagem ponderada em difusão

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...