Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Мы даем особую благодарность Lino Ким, Стив Гусман и Ujit Satyarthi для оказания технической помощи в ходе разработки этого метода. Мирон Hawthorne, Ричард Spengel, и Роберто Рохас обрабатывается камеры, используемые здесь, и при условии, столь необходимую техническую помощь. Примечательно, что Роберто Рохас производится Рисунок 4. Мы также благодарны за ценные советы Скотт Фрейзер до развития выше анализ хемотаксиса. Эта работа была частично поддержана NIH-МУРЗ SCORE-5S06GM048680-13, Медб и награды от ХСС, Northridge Graduate Program Support Диссертация на CW.

1. День 1: Изоляция магистральных труб для нейронных ночной культуры на покровных <ol><li> Инкубируйте куриных яиц в течение 56 ч при 38 ° C. Удалите яйца от инкубации, мягко распылять их с 70% этанола, а затем дайте им высохнуть. Разбейте яйца в открытой УФ-стерилизованные стеклянные панели зада...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Проведение исследования хемотаксиса на магистральных НКС оказалось сложным для ряда причин. Магистральные НКС представляют собой гетерогенную популяцию стволовых клеток, что будет отличать, если культурный долгосрочные, поэтому ствол НКС должно быть получено от первичного эксплант...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Научные </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллина стрептомицин решение </td><td> Omega Научные </td><td> PS-20 </td><td> Концентрация 100X со </td></tr><tr><td> L-Глютамин </td><td> Omega Научные </td><td> GS-60 </td><td> Концентрация 100X со </td></tr><tr><td> Плод бычьего сывороточного </td><td> Omega Научные </td><td> FB-11 </td><td> Лот № 105247 (или другое, что сопоставимо) </td></tr><tr><td> Измененный Zigmond камеры </td><td> Домашняя </td><td> N / A </td><td> Объем резервуара: ~ 160 мкл шт; дополнительные характеристики, см. рис. 4 и дополнительного протокола изготовления </td></tr><tr><td> Блюдо клеточной культуры </td><tD&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 х 10 мм </td></tr><tr><td> Фибронектин </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X со нацелен путем разбавления 1 мг FN в 1 мл H 2 O и 9 мл DMEM </td></tr><tr><td> Покровные </td><td> Рыбак </td><td> 12-548-B </td><td> Предварительно очищенные, 22 х 22 мм </td></tr><tr><td> L15 среде </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Вазелин </td><td> Утешает </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Центрифуги трубы </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 мл </td></tr><tr><td> Диспазы </td><td> Сотовые Системы </td><td> 4Z0-850 </td><td> Концентрация 10X со </td></tr><tr><td> Шприц </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 мл </td></tr><tr><td> Игла </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G х 1,5 дюйма </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Яnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Со 2 мг / мл; 7 моль красителя / моль IgM </td></tr><tr><td> Препаровальный пинцет </td><td> FST </td><td> Разный </td><td> Дюмон № 5 или 55; прямой наконечником, нержавеющей стали или титана </td></tr><tr><td> Вольфрамовой иглы </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Домашние; помещается в контактный держатель </td></tr><tr><td> Blunt щипцы </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Используется для передачи эмбрионов Рингера из яичного желтка </td></tr></tbody></table> Дополнительный протокол: Изготовление изменения Zigmond палата Пожалуйста, обратитесь к рисунку 4 в качестве справочника по протоколу ниже: <ol><li> Покупка лист 3/16 &quot;толстый полированный акриловый (4,45 мм фактической толщины). </li><li> Используя таблицу увидел, вырезать заготовки камере негабаритных к грубой размеры 33,25 мм х 64,57 мм. Это позволяет 3,175 мм дополнительный материал для обработки. </li><li> Установите камеру пустой на VIЮ-В. С фрезерный станок и 6,35 мм (1/4 &quot;) немного фрезы, чистовую обработку стороны камеры, чтобы их точные размеры: 30,07 мм х 61,39 мм. </li><li> Установите камеру пустую на фрезерном станке и найдите в центре пустого вдоль обеих осей х и у с краю поиска, а затем нулю центре города. </li><li> Приобретать камеры высоте (оси), касаясь немного концевой фрезы на верхней поверхности и нулевой высоте. </li><li> Использование 3,91 мм (0,154 &quot;) немного фрезы, смещение немного 3,03 мм вдоль оси х (положительное направление) для первого резервуара. Начать обработку в камеру на глубину 2,84 мм при перемещении вдоль оси у ( Положительное направление) до 7,62 мм (0,300 &quot;), а затем пройти до 7,62 мм (0,300&quot;) в противоположном (отрицательном) направлении до полной длины резервуара 15,24 мм (0,600 &quot;). Смещение немного до 3,03 мм (0,119 &quot;) вдоль оси х (отрицательное направление) и повторите ту же процедуру для второго резервуара. </li><li> Установите камеру на его краюи просверлить отверстие с помощью 1,09 мм (0,043 дюйма) сверлом на конце каждого резервуара (4 общего числа), который соединяется конце резервуара в сторону камеры для загрузки среды в процессе экспериментов. </li><li> Замочите камеры и в теплой мыльной воде, чтобы помочь устранить любые химические загрязняющие вещества. </li><li> Замочить и промыть камеру и в дважды дистиллированной воде, чтобы удалить мыло. Камеры готов к работе, как описано выше. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Подход к анализу миграции эксплантированных клеток (ствол клетки нервного гребня) описывается. Этот метод является недорогим, нежный, и способны различать хемотаксис с обеих хемокинез и других воздействий на миграционный полярности, таких как полученные из межклеточных взаимодействий в рамках первичного ствола нейронной клеточной культуре гребня.

Анализ Магистральные нейронной клеточной миграции Crest с использованием модифицированного Zigmond пробирной палаты

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Производство Чик извлечение эмбрионов для выращивания мышей нервных стволовых клеток Крест

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Воспроизводимые мыши седалищного нерва и Давка Последующие оценки регенерации полного анализа горы мышц

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Нейробластов Анализ: Анализ для создания и обогащения нейронов клетки-предшественники из Дифференцируя нейронных потомков стволовых клеток методом проточной цитометрии

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Co-анализ структуры и функционирования мозга использованием МРТ и диффузно-взвешенных изображений

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...