Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
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Damos un agradecimiento especial a Lino Kim, Steve Guzmán y Satyarthi UJIT de asistencia técnica durante el desarrollo de este método. Myron Hawthorne, Spengel Richard, Rojas y Roberto máquina las cámaras utilizadas aquí y siempre muy necesaria asistencia técnica. Cabe destacar que, Roberto Rojas produjo la Figura 4. También estamos agradecidos por valiosos consejos de Scott Fraser, antes del desarrollo de la prueba de la quimiotaxis de arriba. Este trabajo fue apoyado en parte por un marcador-5S06GM048680-13 NIH-SAM para Medb y por un premio de la CSU Programa, Northridge apoyo de tesis de grado para CW.

1. Día 1: El aislamiento de los tubos neurales del tronco de la cultura durante la noche en cubreobjetos <ol><li> Huevos se incuban chica de 56 horas a 38 ° C. Retire los huevos de incubación, rociar ligeramente con el 70% de etanol, y luego dejar que se sequen. Rompa los huevos se abren en una bandeja de vidrio UV-esterilizados. </li><li> Extracto de cada embrión de su yema y colocarlo en chica de Ringer. Para ello, el primer corte en torno a las islas de sangre con tijeras curvas, y luego, con una pinza roma, el...

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	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. 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E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

La realización de investigaciones sobre la quimiotaxis de los países contribuyentes netos tronco ha demostrado ser un reto para una serie de razones. NCC tronco constituyen una población heterogénea de células madre que va a diferenciar si se cultivan a largo plazo, por lo tanto, los países contribuyentes netos tronco ha de ser obtenida de la explantación de la primaria del tronco a nivel de NT. Los métodos convencionales para estudiar la respuesta quimiotáctica de las poblaciones de células distribuidas homog...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Científico </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de penicilina estreptomicina </td><td> Omega Científico </td><td> PS-20 </td><td> Concentración de 100X </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Omega Científico </td><td> GS-60 </td><td> Concentración de 100X </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Omega Científico </td><td> FB-11 </td><td> Lote # 105247 (o cualquier otro que sea comparable) </td></tr><tr><td> Modificado Zigmond cámara </td><td> Hecho en casa </td><td> N / A </td><td> Volumen de embalse: 160 ~ ea l, para obtener especificaciones adicionales, ver fig. 4 y el protocolo adicional de fabricación </td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> Foto 10 veces más preparada mediante la dilución de 1 mg FN en 1 ml de H 2 O y 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Pescador </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned, 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Jalea de petróleo </td><td> Comodidades </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Tubo de centrífuga </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Sistemas de Celdas de </td><td> 4Z0-850 </td><td> Concentración de 10X </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Aguja </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 pulgadas </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Yonvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Archivo es de 2 mg / ml, 7 moles tinte / mol IgM </td></tr><tr><td> Pinza de disección </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont n º 5 o el 55, con punta recta, acero inoxidable o titanio </td></tr><tr><td> Aguja de tungsteno </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Hecho en casa, coloca en un soporte de pasador </td></tr><tr><td> Blunt Forceps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Se utiliza para transferir los embriones al Ringer de yema de huevo </td></tr></tbody></table> Protocolo Suplementario: Fabricación de una cámara modificada Zigmond Por favor refiérase a la Figura 4 como referencia para el protocolo siguiente: <ol><li> Compra de una hoja de 3 / 16 &quot;de espesor de acrílico pulido (4,45 mm de espesor real). </li><li> Utilizando una sierra de mesa, cortar los espacios en blanco cámara de gran tamaño a las dimensiones aproximada de 33,25 mm x 64,57 mm. Esto permite a los 3.175 mm de material adicional para el mecanizado. </li><li> Set en blanco en una cámara de vise. Con una fresadora y un 6,35 mm (1 / 4 &quot;) poco la fresa, el acabado de mecanizado de los lados de la cámara a sus dimensiones exactas: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> La posición de la cámara en blanco en la máquina de fresado y localizar el centro del blanco a lo largo de los dos ejes X e Y con un palpador de aristas, y luego a cero la ubicación del centro. </li><li> Adquirir la altura de la cámara (eje Z) al tocar la fresa final a la superficie superior y el cero de la altura. </li><li> El uso de un 3,91 mm (0,154 &quot;) poco la fresa, compensar el poco 3,03 mm a lo largo del eje X (dirección positiva) para el primer depósito. Comienza de mecanizado en la cámara hasta una profundidad de 2,84 mm mientras que se mueve a lo largo del eje Y ( dirección positiva) de 7,62 mm (0,300 &quot;) y luego atravesar a 7,62 mm (0,300&quot;) en la dirección opuesta (negativa) en dirección a una longitud total de embalse de 15,24 mm (0,600 &quot;). Compensar el poco a 3,03 mm (0,119 &quot;) a lo largo del eje X (sentido negativo) y repetir el mismo proceso para el segundo depósito. </li><li> Posición de la cámara en su extremoy hacer un agujero con un 1,09 mm (0,043 pulgadas) broca en el extremo de cada depósito (4 en total) que conecta el extremo del depósito al lado de la cámara de carga media durante la experimentación. </li><li> Sumerja la cámara bien en agua tibia y jabón para ayudar a eliminar todos los contaminantes químicos. </li><li> Remojo y enjuague la cámara bien en agua doblemente destilada para eliminar todo el jabón. Las cámaras están ahora listos para su uso como se describió anteriormente. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Las células de la cresta neural (CCN) son una población transitoria de células presentes en el desarrollo de vertebrados que emigrar del tubo neural dorsal (NT) tras someterse a un 1,2 transición epitelio-mesenquimal. Después de la EMT, los países contribuyentes netos migrar grandes distancias a lo largo de las vías estereotipados hasta alcanzar sus objetivos. NCC diferenciarse en una amplia gama de tipos de células incluyendo neuronas, células gliales, los melanocitos, células cromafines y 1-3. La capacidad de los países contribuyentes netos para alcanzar y reconocer a sus lugares de destino adecuado es fundamental para la formación adecuada de todas las estructuras que contienen tronco NCC componentes derivados 3. Elucidar los mecanismos de orientación para el tronco NCC migración ha sido por lo tanto, una cuestión de gran importancia. Numerosas moléculas se ha demostrado que guía la migración NCC 4. Por ejemplo, los países contribuyentes netos tronco se sabe que son repelidos por las señales negativas como la orientación semaforina, efrina, y ligandos de hendidura 5-8. Sin embargo, nohasta hace poco cualquier quimiotácticos de los países contribuyentes netos tronco se han identificado 9. Convencionales métodos in vitro para estudiar el comportamiento quimiotáctico de células adherentes mejor trabajar con inmortalizado, las células homogéneamente distribuidos, pero son más difíciles de aplicar a ciertos cultivos primarios de células madre que inicialmente carecen de una distribución homogénea y diferenciar rápidamente (por ejemplo, los países contribuyentes netos). Un enfoque para homogeneizar la distribución de los países contribuyentes netos del tronco de los estudios de quimiotaxis es aislar a los países contribuyentes netos tronco de cultivos primarios de explantes NT, a continuación, levante y replate a ser casi el 100% confluente. Sin embargo, este enfoque requiere de placas grandes cantidades de tiempo y esfuerzo para explante número suficiente de células, es duro, y distribuye los países contribuyentes netos del tronco de una manera diferente a la que se encuentra en condiciones in vivo. Aquí, se presenta un enfoque in vitro que es capaz de evaluar la quimiotaxis y otras respuestas migratorias de los países contribuyentes netos tronco sin requiringa la distribución de células homogéneas. Esta técnica utiliza imágenes a intervalos de tiempo de la primaria, imperturbable NCC tronco dentro de una cámara modificada Zigmond (una cámara estándar de Zigmond se describe en otro 10). Mediante la exposición de los países contribuyentes netos del tronco en la periferia de la cultura a un gradiente de chemotactant que es perpendicular a su direccionalidad predijo naturales, las alteraciones en la polaridad migratorios inducidos por el gradiente de chemotactant aplicada puede ser detectado. Esta técnica es de bajo costo, requiere el cultivo de sólo dos explantes por tratamiento NT replicar, evita la elevación de células duras (por ejemplo, tripsina), las hojas de los países contribuyentes netos tronco en una distribución más similar a las condiciones in vivo, reduce la cantidad de tiempo que transcurre entre la explantación y la experimentación (lo que probablemente reduce el riesgo de diferenciación), y permite lapso de tiempo la evaluación de numerosas características migratorias.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Un enfoque para analizar la migración de las células explantados (células troncales de la cresta neural) se describe. Este método es barato, amable y capaz de distinguir la quimiotaxis de los dos quimiocinesis y otras influencias en la polaridad migratorias, como las derivadas de las interacciones célula-célula en el tronco principal cultivo de células neuronales de la cresta.

El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Investigación

Neurociencias

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Co-análisis de la estructura y función cerebral mediante resonancia magnética funcional y la difusión de imágenes ponderado

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...