Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Vi ger ett särskilt tack till Lino Kim, Steve Guzman och Ujit Satyarthi för tekniskt stöd under utvecklingen av denna metod. Myron Hawthorne, Richard Spengel, och Roberto Rojas bearbetas kamrarna används här och som välbehövlig tekniskt bistånd. Noterbart producerade Roberto Rojas Figur 4. Vi är också tacksamma för Scott Frasers ovärderliga råd inför utvecklingen av den ovan kemotaxianalys. Detta arbete stöddes delvis av en NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 till Medb och en utmärkelse från CSU, Northridge Examensarbete stödprogram för CW.

1. Dag 1: Isolering av bålen neurala rör för övernattning kultur på täckglas <ol><li> Inkubera chick ägg för 56 timmar vid 38 ° C. Ta bort ägg från inkubation milt spraya dem med 70% etanol, och låt dem torka. Bryt äggen öppna i en UV-steriliserad glastallriken. </li><li> Utdrag varje embryo från sin äggula och placera den i chick Ringers. Gör detta genom att först skära runt dess blod öar med böjda sax, sedan med trubbiga pincett, plocka embryot upp av dess extraembryonic membran och placera den ...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Genomföra kemotaxi forskning på bål NCC har visat utmanande för en rad skäl. Trunk NCC utgör en heterogen befolkning stamceller som kommer att skilja om odlade lång sikt, därför måste trunk NCC erhållas från primär explantation av stammen nivå NT. Konventionella metoder för att studera den kemotaktiska responsen av homogent fördelade cellpopulationer in vitro är svåra att testa på bålen NCC sedan de först kräver att cellerna är isolerade och homogent återpläterade i kemotaxi kammare (t....

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Scientific </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin Solution </td><td> Omega Scientific </td><td> PS-20 </td><td> 100X stamkoncentration </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Omega Scientific </td><td> GS-60 </td><td> 100X stamkoncentration </td></tr><tr><td> Fetalt bovint serum </td><td> Omega Scientific </td><td> FB-11 </td><td> Sats # 105.247 (eller annan som är jämförbar) </td></tr><tr><td> Modifierad Zigmond kammare </td><td> Hem gjorde </td><td> N / A </td><td> Behållarvolym: ~ 160 ul EA, för ytterligare specifikationer, se figur. 4 och den supplementära tillverkning protokollet </td></tr><tr><td> Cellodling skålen </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> BD </td><td> 354.008 </td><td> 10X lager prepped genom spädning 1 mg FN i 1 ml H-2 O och 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> Fisher </td><td> 12-548-B </td><td> Förrenade, 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15-medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vaselin </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Centrifugrör </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispas </td><td> Cellsystem </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X stamkoncentration </td></tr><tr><td> Spruta </td><td> BD </td><td> 309.602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nål </td><td> BD </td><td> 305.127 </td><td> 25 G x 1,5 tum </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Jagnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Lager är 2 mg / ml, 7 mol färgämne / mol IgM </td></tr><tr><td> Dissekera Tång </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 eller 55, rak spets, rostfritt stål eller titan </td></tr><tr><td> Volfram nål </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Hemgjorda, placeras i ett stift hållare </td></tr><tr><td> Blunt Tång </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Används för överföring embryon till Ringers från äggula </td></tr></tbody></table> Kompletterande protokoll: Tillverkning av en modifierad Zigmond avdelning Se Figur 4 som referens för protokollet nedan: <ol><li> Köp ett ark med 3/16 &quot;tjock polerad akryl (4,45 mm Verklig tjocklek). </li><li> Med hjälp av en tabell och såga kammare ämnen överdimensionerade för grova dimensionerna 33,25 mm x 64,57 mm. Detta tillåter 3,175 mm extra material för maskinbearbetning. </li><li> Ställ kammaren ämnet på en VIse. Med en fräsmaskin och en 6,35 mm (1/4 &quot;) pinnfräs bit, färdigbearbetning sidorna av kammaren till deras exakta mått: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Placera kammaren tom på fräsmaskin och lokalisera mitten av ämnet längs både x-och y-axlarna med en kantavkännare, sedan nollställa centrum. </li><li> Förvärva kammarens höjd (z-axeln) genom att trycka på bit ändfräsen med den övre ytan och nollställa höjden. </li><li> Med användning av en 3,91 mm (0,154 &quot;) pinnfräs bit, offset bit 3,03 mm längs x-axeln (positiv riktning) för den första behållaren. Börja bearbetningen in i kammaren till ett djup av 2,84 mm, medan rör sig längs y-axeln ( positiv riktning) till 7,62 mm (0,300 &quot;) och sedan passera till 7,62 mm (0,300&quot;) i motsatt (negativ) riktning till en komplett behållare längd av 15,24 mm (0,600 &quot;). Kompensera lite till 3,03 mm (0,119 &quot;) längs x-axeln (negativ riktning) och upprepa samma process för den andra behållaren. </li><li> Placera kammaren på sin kantoch borra ett hål med en 1,09 mm (0,043 tum) borr på änden av varje behållare (4 totalt) som förbinder änden av behållaren till den sida av kammaren för lastning medium under experiment. </li><li> Blötlägg kammaren väl i varmt tvålvatten för att ta bort eventuella kemiska föroreningar. </li><li> Blötlägg och skölj kammaren väl i dubbeldestillerat vatten för att ta bort tvål. Kamrarna är nu redo för användning såsom beskrivits ovan. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Neurala crest celler (NCC) är en övergående population av celler närvarande i vertebrat utveckling som emigrera från den dorsala neuralröret (NT) efter att ha genomgått en epitelial-mesenkymala övergång 1,2. Efter EMT, NCC migrera stora avstånd längs stereotypa vägar tills de når sina mål. NCC differentierar till ett brett spektrum av celltyper inklusive nervceller, glia, melanocyter och kromaffinceller 1-3. Förmåga NCC att nå och erkänna deras rätt målplatser är grundläggande för lämplig bildning av alla strukturer som innehåller stammen NCC-härledda komponenter 3. Belysa mekanismerna för vägledning för bål NCC migrationen har därför varit en fråga av stor betydelse. Talrika molekyler har visats styra NCC migrering 4. Till exempel, är trunk NCC känt att repelleras av negativa vägledning ledtrådar såsom semaforin, ephrin, och ligander Slit 5-8. Men intetills nyligen har kemoattrahenter av bålen NCC identifierats 9. Konventionell in vitro metoder för att studera kemotaktiska beteende vidhäftande celler fungerar bäst med odödliggjorda fördelade likartad celler, men är mer utmanande att på vissa primära stamcellskulturer som initialt saknar en homogen fördelning och snabbt skilja (såsom NCC). Ett sätt att homogenisera fördelningen av bålen NCC för kemotaxi studier är att isolera trunk NCC från primära NT explantation kulturer lyft och förnyad utbredning dem att vara nästan 100% sammanflytande. Detta kräver dock plätering metod stora mängder tid och ansträngning att explantera tillräckligt många celler, är hård, och distribuerar trunk NCC på ett olik sätt som finns i in vivo förhållanden. Här rapporterar vi en in vitro metod som kan utvärdera kemotaxi och andra flyttande svar bålen NCC utan requiringa homogen cellfördelning. Denna teknik utnyttjar time-lapse avbildning av primära, ostörda trunk NCC i en modifierad Zigmond kammare (en vanlig Zigmond kammare beskrivs på annat håll 10). Genom att exponera trunk NCC vid periferin av kulturen till en chemotactant lutning som är vinkelrät mot deras förutsagda naturligt riktverkan, kan förändringar i flyttande polaritet inducerade av den pålagda chemotactant gradienten detekteras. Denna teknik är billig, kräver odling av endast två NT explantat per replikat behandling, undviker hårda celler lyft (såsom trypsinering), lämnar trunk NCC i en mer likartad distribution till in vivo förhållanden, skär ner den tid mellan explantation och experiment (vilket minskar troligen risken för differentiering), och tillåter tidsförlopp utvärdering av ett stort antal vandrande egenskaper.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Ett tillvägagångssätt att analysera migration av explanterade celler (stam neurallisten celler) beskrivs. Denna metod är billig, mild och kan särskilja kemotaxi från både kemokines och andra influenser av flyttande polaritet såsom de härledda från cell-cell-interaktioner inom den primära stammen neurallisten cellodling.

Analys av Trunk neurallist cellmigration med en modifierad Zigmond Chamber analys

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Produktion av Chick Embryo Extract för odling av murina neurala celler Crest Stem

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-kolonibildande Cell-analys: en analys att diskriminera Bona Fide neuronala stamceller från neurala stamceller

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolering och odling av neurala celler Crest härrör från mänskliga hårsäckar

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Reproducerbar Mouse ischiasnerv krossa och påföljande bedömningen av Regeneration av Whole Mount Muscle Analys

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Analys av Neural Crest migration och differentiering av Cross-arter Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Samtidig analys av hjärnans struktur och funktion med fMRI och diffusion-viktade bilder

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...