Name: analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Biz bu yöntemin geliştirilmesi sırasında teknik yardım için Lino Kim, Steve Guzman ve Ujit Satyarthi özel şükretmezler. Myron Hawthorne, Richard Spengel ve Roberto Rojas burada kullanılan odaları işlenmiş ve çok ihtiyaç duyulan teknik yardım sağlamıştır. Özellikle, Roberto Rojas Şekil 4 üretti. Biz de yukarıda kemotaksis assay gelişimi öncesinde Scott Fraser değerli tavsiyeler için müteşekkiriz. Bu çalışma kısmen bir NIH-MBR SKOR-5S06GM048680-13 Medb ait ve CW CSU, Northridge Lisans Tez Destekleme Programı bir ödül tarafından desteklenmiştir.

1. 1. Gün: lamelleri gecede kültür gövde nöral tüp İzolasyonu <ol><li> 38 az 56 saat süreyle civciv yumurta inkübe ° C inkübasyon yumurta çıkarın, hafif% 70 Etanol ile onları sprey, ve sonra onları kurutun. UV-steril cam tepsi içine açık yumurtaları kırın. </li><li> Sarisi her embriyo ayıklayın ve civciv Ringer yerleştirin. Kavisli makas ile kan adaların etrafında ilk kesim tarafından bu yapın; ardından, künt forseps ile, onun extraembryonic zarla embriyo pick up ve civciv Ringer çözel...

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

Gövde NCCS üzerine kemotaksis araştırmaların yapılması nedenlerle bir dizi için zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, gövde NCCS gövde düzeyinde NT birincil eksplantasyonunun alınmalıdır; Trunk NCCS kültürlü uzun vadede ise farklılaştıracak bir heterojen kök hücre popülasyonu oluşturur. In vitro homojen dağıldığı hücre popülasyonlarının kemotaktik yanıtı incelemek için konvansiyonel yöntemler onlar ilk hücreler izole ve kemotaksis odası (örneğin, bir Boyden çember...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Bilimsel </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin Çözüm </td><td> Omega Bilimsel </td><td> PS-20 </td><td> 100X Stok Konsantrasyon </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Omega Bilimsel </td><td> GS-60 </td><td> 100X Stok Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Omega Bilimsel </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (veya karşılaştırılabilir başka) </td></tr><tr><td> Modifiye Zigmond odası </td><td> Home made </td><td> N / A </td><td> Rezervuar hacmi: ~ 160 ul adet, ek özellikler için, bkz. 4 ve ek imalat protokolü </td></tr><tr><td> Hücre kültürü çanak </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X Hazır 1 ml H2O ve 9 ml DMEM içinde 1 mg FN seyreltilmesi ile prepped </td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Balıkçı </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned; 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 orta </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Vazelin </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Santrifüj tüpü </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Hücre Sistemleri </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X Stok Konsantrasyon </td></tr><tr><td> Şırınga </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Iğne </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 inç </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Bennvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Hazır 2 mg / ml &#39;dir; 7 mol boya / mol IgM </td></tr><tr><td> Diseksiyon Forseps </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 veya 55; düz uçlu, paslanmaz çelik ya da titanyum </td></tr><tr><td> Tungsten İğne </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Ev yapımı; pim tutucu yerleştirilir </td></tr><tr><td> Blunt Forseps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Yumurta sarısı Ringer embriyo transferi için kullanılır </td></tr></tbody></table> Ek Protokol: Modifiye Zigmond Odası Fabrikasyon Aşağıdaki protokol için bir referans olarak Şekil 4&#39;e bakınız: <ol><li> 3/16 &quot;kalınlığında akrilik cilalı (4.45 mm gerçek kalınlığı) bir levha satın alın. </li><li> Bir tablo kullanarak 33,25 mm x 64,57 mm kaba boyutları normalden büyük kamara boşlukları kesip, gördüm. Bu işleme için 3.175 mm ekstra malzeme sağlar. </li><li> Bir vi odacık blank ayarlayınse. 30.07 mm x 61.39 mm: Bir freze makinesi ve 6,35 mm (1/4 &quot;) freze ucu, finiş onların tam boyutlarına odasının tarafı ile. </li><li> Freze makinesi üzerindeki odacık blank konumlandırın ve x ve bir kenar bulucu ile y ekseni hem boyunca boş merkezinin yerini, sonra merkezi konumu sıfır. </li><li> Üst yüzeyine sonuna değirmen biraz dokunarak odası yüksekliği (z-ekseni) Edinme ve yüksekliği sıfır. </li><li> Bir 3.91 mm (0,154 &quot;) freze ucu kullanarak, ilk rezervuar için x-ekseni (pozitif yönde) boyunca bit 3.03 mm ofset. Y-ekseni boyunca hareket ederken (2.84 mm derinliğe kadar odasına işleme başlayın 7.62 mm (0.300 ile) yönünde pozitif 15.24 mm (0.600 &quot;) tam bir rezervuar uzunluğa karşı (negatif) yönünde)&quot; O) ve 7.62 mm (0.300 ile çapraz &quot;. X-ekseni (negatif yönünde) 3.03 mm (0.119 &quot;) için bit Ofset ve ikinci hazne için aynı işlem tekrarlayın. </li><li> Onun kenarında odasına yerleştirinve deney sırasında orta yükleme odasının yan rezervuarın sonunda her bağlandığında rezervuar (toplam 4) ucunda bir 1.09 mm (0.043) matkap ucu kullanarak bir delik açın. </li><li> Herhangi bir kimyasal kirleticiler kaldırmak için ılık sabunlu su ile iyice odası bekletin. </li><li> Herhangi bir sabun kaldırmak için çift distile su ile iyice odası bekletin ve durulayın. Odası hemen yukarıda tarif edildiği gibi kullanıma hazırdır. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Nöral krest hücrelerinden (NCCS) epitelyal-mezenkimal geçiş 1,2 geçirildikten sonra dorsal nöral tüp (NT) göç omurgalı gelişimi mevcut hücrelerin geçici bir nüfusu vardır. Onların hedeflerine ulaşana kadar EMT ardından NCCS stereotipik yollar boyunca büyük mesafeler göç. NCCS nöronlar, glia, melanosit ve 1-3 kromaffin hücreleri de içeren farklı hücre tipleri geniş bir dizi farklılaşırlar. Onların doğru hedef konumlarına ulaşmak ve tanımak NCCS yeteneği gövde bileşenleri 3 NCC-türetilmiş içeren tüm yapıların uygun oluşumu için temel olduğunu. Gövde KKK göç için rehberlik mekanizmalarının aydınlatılmasına dolayısıyla büyük önem taşıyan bir konu olmuştur. Sayısız molekülleri KKK göç 4 yol gösterilmiştir. Örneğin, gövde NCCS bu tür Semaphorin, efrin ve yarık ligandları olarak 5-8 negatif kılavuz işaretler tarafından uzaklaştırılacaktır bilinmektedir. Ancak,Son zamanlarda gövde NCCS 9 belirlenmiştir herhangi chemoattractants kadar. Yapışık hücrelerin kemotaktik davranışlarını incelemek üzere in vitro yaklaşımlar Konvansiyonel ölümsüzleştirdiği, homojen dağıldığı hücreler en iyi şekilde çalışır, ancak başlangıçta homojen bir dağılım eksikliği ve hızla (örneğin NCCS gibi) ayırt bazı primer kök hücre kültürleri uygulamak daha zor. Kemotaksisi çalışmaları için gövde NCCS dağılımı homojenize Bir yaklaşım birincil NT eksplant kültürlerden gelen gövde NCCS izole etmektir, sonra kaldırın ve onları neredeyse% 100 konfluent olmak replate. Ancak, bu kaplama yaklaşım, zaman ve yeterli hücre eksplantasyona çaba önemli miktarda gerektirir sert olduğunu, ve in vivo koşullarda bulunan bir farklı şekilde gövde NCCS dağıtır. Burada, requirin olmadan gövde NCCS arasında kemotaksis ve diğer göçmen yanıtları değerlendirmek mümkün bir in vitro yaklaşımı raporhomojen hücre dağılımı ga. Bu teknik, primer time-lapse görüntüleme kullanan bir modifiye Zigmond odası (standart Zigmond odası başka bir yerde 10 açıklanan) iç gövde NCCS soğukkanlı. Bunların tahmin edilen doğal yön dik bir chemotactant gradyanı ile kültür çevresinde yer alan gövde NCCS açığa olarak, uygulanan chemotactant gradyanı ile oluşturulan göç polarite değişiklikler tespit edilebilir. Bu teknik, ucuz çoğaltma tedavi başına sadece iki NT eksplant kültür gerektirir, sert hücre kaldırma (örneğin tripsinizasyonla gibi) önler vivo koşullarda bir daha benzer dağılımda gövde NCCS bırakır eksplantasyonunun ve deneme arasındaki süreyi aşağı kesim (hangi büyük olasılıkla farklılaşma riskini azaltır), ve çok sayıda göçmen özellikleri time-lapse değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay at JoVE.com

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Eksplante hücreleri (gövde nöral krest hücreleri) göçü analiz etmek bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, pahalı yumuşak, ve bu gibi ana gövde tepe nöral hücre kültürü içinde hücre-hücre etkileşimleri türetilmiş olanlar gibi, göç polarite hem chemokinesis ve diğer etkilerden kemotaksisi ayrım yapabilmektedir.

Bir Modifiye Zigmond Odası Testi kullanılarak Trunk Sinir Crest Hücre Göç Analizi

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

Civciv Embriyo Özü murin Sinir Crest Kök Hücre Yetiştiriciliği Üretimi

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

İnsan Saç köklerinin arasından Sinir Crest Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

FMRI ve difüzyon ağırlıklı görüntüleme ile Beyin Yapısı ve Fonksiyonu Co-analizi

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...