Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af National Science Foundation, McKnight Endowment Fonden for Neuroscience, at Christopher og Dana Reeve Foundation og Amerisure Charitable Foundation.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Der er flere gode diskussioner af laser mikrokirurgi med forskellige lasersystemer 3,5-11. Femtosekund IR-lasere er &quot;gold standard&quot; for subcellulære laser ablation 12 og praktisk, hvis forbundet med en imaging facilitet, men de er ofte for dyre for de enkelte brugere. Hvis du har brug for en femtosekund IR-laser for imaging din prøve på grund af dybden af ​​billeddata, så vil du sandsynligvis brug for én til laser axotomy. Transparent væv med target axoner inden for 30-50 um af overfladen er sandsynligvis mulig med blå og grønne puls lasere i de 20 UJ / puls interval målrettet gennem en høj na fordybelse linse. Der vil være flere følgeskaderne med nano og pico sekunder lasere sammenlignet med femtosekund laser, især da dybden af målet Axon stiger. C. elegans er gennemsigtig og alle axoner er indenfor 20-30 um af overfladen. Vi rutinemæssigt skåret motoriske axoner, der er inden for 5 UM af overfladen. Vi har også let skåret økseons inden den nerve ring, der er omkring 20 UM fra neglebånd overfladen. Vi har fundet grænsen for at skære axoner at være omkring 30-50 um gennem diameteren af ​​en voksen orm. Det er sandsynligt, at laser-ablation systemet beskrives her, vil fungere godt med mange forskellige præparater, som passer til kriterierne om gennemsigtighed og dybde af mål axoner. Men det er en smule overraskende i betragtning af den teoretiske fordele ved femtosekund IR-lasere, som nano-og picosekund 355 nm og 532 nm laser udføre så godt for laser axotomy i C. elegans 6,13. Vi ser ingen forskelle i Axon regenerering som reaktion på laser axotomy med nanosekund 440 nm, nanosekund 532 nm, og femtosekund IR-lasere. Solid state 355 nm UV-lasere er omkring samme pris som de 532 nm diode pumpes passivt Q-Switched solid state laser, men det kræver enten højere magter eller optik, der effektivt videregive disse kortere bølgelængder. De fleste optik er designet til at klare sig godt med synlig 400 -700 nm lys. 355 nm lasere ville give nogle fordele 6 såsom reduceret plasma-tærskel, mindre spot størrelse, og en lang aflevering dichroic ville effektivt direkte 100% af ablation laser til målet og tillade samtidige billeder af GFP uden tab af prøve signal. Blå 440 nm lasere ville bevare fordelene ved at arbejde med et synligt lys laser (gode resultater med standard optik og sikkerhed). Desværre er prisen for en DPP Q-switched solid state 440 nm laser er 3 gange prisen for en 355nm eller 532 nm laser af lignende effekt på dette tidspunkt. Hvis vi skulle designe et nyt system til C. elegans, hvor målet dybde er minimal, vil vi vælge en UV gennemsigtig linse (koste omkring $ 3.000 for en 40X 1.3na olie-objektiv med 50-70% transmission på 355nm) og en 355 nm laser producerer 5-10 UJ / puls ved 1 -20 kHz. Axon ablation menes at skyldes plasma dannelse. Kortere impulser vil producere plasma tærskler på et lavere el-og plasma-volumen w<html> dårligt være mindre 6. Målet er at producere den mindste og korteste levetid plasma ved at justere pulsen energi til det laveste strømforbrug. Større langlivede plasmaer vil generere kavitation bobler, der skader omkringliggende celler. Vi har generelt konstateret, at ablation bruger omkring 50-100 pulser på højeste frekvens (dvs. 2.5kHz) giver de bedste resultater. Dette tyder på, at skaden kan gradvist integreret over en række impulser til bedre at kontrollere omfanget af skader. Den laser ablation system, der beskrives her, er meget tilgivende, hvis strålen er justeret og udvidet præcist. Vi starter skære axoner hos voksne orme på 10% laser effekt (gennemsnit på 0,3 mW, målt ved 2500 Hz, og anslået 1 UJ / puls) og kan skæres med begrænset lokal skade gennem 14% effekt. Du kan observere store områder med skader fra 15 til 39% laser magt, men kun over 40% effekt (ca. 1 mW gennemsnit målt ved 2500 Hz) gøre ormene eksplodere på grund af store kavitation bobler og skader på orme-neglebånd. e_content &quot;&gt; Den Steinmeyer et al. 2010 2 papiret er en fremragende ressource for at konstruere en laser ablation system. Leon Avery har også en dejlig praktisk beskrivelse af en laser ablation system baseret på en billig N2 gas 337 nm laser, og han giver nogle store praktiske rådgivning (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Når designe dit eget system, bør du først tale med din mikroskop repræsentant for at afgøre, hvorledes den vil øremærke ablation laser til mikroskopet mål. Din mikroskop skal monteres på et vibrationsisolering tabel (Newport, TMI, Thor). En breadboard top er optimal, men et massivt stål toppen kan stadig bruges med magnetisk svejseborde. En dedikeret mellemliggende modul på en opretstående anvendelsesområde er rart, fordi alle optiske elementer kan blive siddende på plads. Men det kan være billigere og mere bekvemt at bruge et kamera port (inverteret) eller en &quot;combiner&quot; vedhæftet en epi-fluorescerende port. Du skal kende størrelsen af ​​ryggen blænde og transmittans (på A<html> blation laser bølgelængde) i objektivlinsen du agter at bruge. Når du beslutter dig for en laser (f.eks Crylas, vrimle, Crystal, eller CRC), bør du kontakte Thor eller Newport for at få hjælp til at vælge den korrekte optiske elementer, hardware og sikkerhedsudstyr. Vi besluttede på en dual galilæiske beam expander for at spare plads, men en enklere Kepler-expander er en mulighed (f2/f1 = ekspansion faktor). En brugerdefineret beam expander vil være den billigste, men Newport, Thor, og flere af de laser producenter tilbyder fremragende kvalitet kommercielle stråle ekspandere. Nogle laser producenter tilbyder også manuel og elektronisk styrede dæmpeled, der kan være omkostningseffektive og pladsbesparende, men ikke lige så alsidig som de Glan-Thompson polarisator og halvdelen bølge plade. Du bliver også nødt til at beslutte, hvordan man styrer laseren. Du kan designe en LabView baseret controller, kan du bruge en kommerciel TTL generator, eller software, som laser virksomheden. Drøft muligheder med den specifikke laser producenten. telt &quot;&gt; Vi har fremlagt en liste over den hardware, vi har kun bruges som en generel vejledning. Systemet er beskrevet her koste omkring $ 15,000, når tilføjet til vores eksisterende imaging system. Din lokale Fysik afdeling vil ofte have nogen er villige til at give en praktisk introduktion til sikkert at arbejde med fri stråle lasere. Alternative metoder til immobilisering og tid bortfalder billeddannelse af C. elegans er for nylig blevet beskrevet. 14 Fejlfinding Den mest vanskelige og kritiske skridt er opretning af centreret udvidet strålen til den optiske akse af mikroskopet. Når du har strålen centreret og udvidet gennem de Galileiske linser du skal arbejde hårdt for at få den tilpasset til inden for 5 UM af mikroskopet optiske akse, FØR du bruger styretøjet spejle til den endelige tilpasning til centrum. Overdreven brug af styre-spejle for at justere strålen til mikroskop vil flytte den off axis gennem strålenexpander. BRUG yderste forsigtighed kan du dæmpe laserstrålen med de relevante ND filteret og direkte se laserstrålen profil på en reflekterende mål (forreste overflade spejl). Du kan forsigtigt skubbe mikroskop til præcist at centrere bjælke i 60X målet synsfelt (hvis det ikke kan centreres i op / ned interval, du har brug for at justere skinnen højde). Strålen profil kan bruges til præcist at justere mikroskopet optiske akse for at give en centreret bom, der er cirkulær og &quot;blusser&quot; symmetrisk. En asymmetrisk flare er et tegn på, at mikroskopet aksen ikke er perfekt afstemt (eller skinnen er ikke niveau). Endelig bør du justere L3 og se et jævnt og symmetrisk udvidelse og sammentrækning af bjælken. Fokus mikroskopet præcist på målet overfladen og derefter justere L3 til at fokusere laserstrålen til den mindste plet. Du skal nu finde, at laserstrålen er inden for 5 UM i midten, når filmede via LSCM eller CCD-system og ablation stedet er inden for1um af Z fokus. Hvis du opdager, at du er &quot;sprænge&quot; orme eller konstant generere store kavitation bobler til at skære axoner dit problem er sandsynligvis den fine tilpasning af ablation laser. Sørg for minimum (&lt;500 Nm) ablation stedet er lokaliseret til Z fokus (justering konvergens med L3 objektiv) og til XY betroede stedet (juster med sidste kinematically monteret spejl). Målretning axoner tættere på overfladen vil kræve mindre laser strøm. Ligeledes vil mindre dyr (L1 og L2) kræver mindre laser strøm til axotomy i forhold til at målrette den samme axoner hos voksne. Hvis dine vilde type axoner ikke regenerere eller axoner blegemiddel, bør du prøve at reducere billedbehandling laser magt eller nedsætte samplingfrekvens. Hvis din orme dø eller blive syg forsøge at reducere procent Agarose i 1% trin. Sørg for at du ikke bevæger dækglasset efter montering orme, da dette ofte vil få dem til at dø, når du bruger high prejen agarose og mikrosfærer. Hvis din orme briste eller dør under en time-lapse session det skyldes: 1. Procentdel agarose er for høj. 2. Skader på neglebånd ved ablation laser. 3. Flytning af dækglasset efter montering. Hvis skader på neglebånd er skyld i ulykken, vil kun påvirke monteret orme, der er blevet målrettet med ablation laser. Hvis din orm bevæger sig for meget under en time-lapse session du prøve at øge den procentdel agarose i 0,5% trin. Sund axoner hos raske orme er altid &quot;aktive&quot; og vise et ensartet fluorescens. Hvis du ser et pludseligt fald i fluorescens eller aktivitet ormen er døende eller døde. Flere beaded eller fragmenteret axoner er et sikkert tegn på en døende eller døde orm. Hvis du har problemer med at holde din axoner i fokus i hele den tid bortfalder sessionen kan der være flere forskellige problemer. Først kontrollere din stage drift ved billeddannelse en inaktiv prøve på en glasplade over 10 timerrs. Et par mikron drive kan skyldes termiske ustabilitet, men større end 5 um skyldes formentlig, at mekaniske problemer med dit mikroskop. Problemer med montering er mere almindelige. Lad din monteret orme ligevægt med din mikroskop scenen i 30 minutter, før du starter din tid bortfalder. Kontroller, at din Vaseline segl ikke udviklede lækager i løbet af din tid bortfalder session.

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagenset </th><th> Firma </th><th> Katalog nummer </th><th> Kommentarer (valgfri) </th></tr><tr><td> 535 nm Laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (Vrimle, Crystal, og CRC tilbyder også sammenlignelige lasere) </td></tr><tr><td> Alle optik og hardware </td><td></td><td></td><td> (Thor tilbyder sammenlignelige optik og hardware) </td></tr><tr><td> SUPREMA Optisk Mount, 1,0-i diameter </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter indlæg, 1&quot; højde </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter indlæg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Akromatisk Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave retardering, 400-700 nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotation Stage, 1 &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter indlæg, 1&quot; højde </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter indlæg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Calcit polarisator, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarisator Rotation Mount </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;spacer for 1&quot; diameter indlæg </td><td> Newport </td><td> PS-0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;højde, 1&quot; diameter indlæg </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Gaffel, 1 &quot;diameter indlæg </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Beam Dump </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscope objektiv Mount </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter indlæg, 1&quot; højde </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter indlæg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG Laser Mirror, 25,4 mm Diameter, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA Optisk Mount, 1,0 tommers diameter, clearance monteringshul </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> High Precision Knob justeringsskrue, 12.7mm rejser, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tråd adapter, ¼ -20 mænd, 8-32 kvinder </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Klips til 1,5 tomme diameter stang </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 tommer (35,5 cm) høj </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Rail bærestof for X26, firkantet 40 mm længde </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stålskinne, 384mm (15 &quot;) længde </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rod Platform for 1,5 tommer diameter stang </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 tommer (35,5 cm) høj </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Konkav Lens, 12.7mm diameter,-25mm EFL, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-konveks linse, 25,4 mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-konveks linse, 25,4 mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fast Lens Mount, 0,5 &quot;diameter, 1,0&quot; Axis højden </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Fast Lens Mount, 1,0 &quot;diameter, 1,0&quot; Axis højden </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mikrosfærer 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO spørgsmål </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser axotomy efterfulgt af time-lapse mikroskopi er et følsomt assay for Axon regenerering fænotyper i C. elegans 1. Den største vanskelighed i denne test er den oplevede omkostninger ($ 25-100K) og teknisk ekspertise, der kræves for at gennemføre en laser ablation-system 2,3. Dog kan solid state puls lasere med beskedne omkostninger (&lt;$ 10K) giver robuste ydeevne til laser ablation i transparente præparater, hvor målet axoner er &quot;tæt&quot; på vævet overflade. Konstruktion og tilpasning af et system kan ske på en dag. Den optiske bane, som lyset fra fokuseret kondensatoren til ablation laser giver en bekvem tilpasning guide. En mellemliggende modul med alle fjernede optik kan blive dedikeret til ablation laser og forsikrer at ingen optiske elementer, der behøver at være flyttet i løbet af en laser-ablation session. En dichroic i de mellemliggende modulet giver mulighed for samtidig billedbehandling og laser ablation. Centrering laserstrålen to den udgående stråle fra den fokuserede mikroskopet kondensator linse guider den indledende tilpasning af systemet. En række af linser er vant til stand og udvide laserstrålen at udfylde bagsiden blænde af den valgte objektivlinsen. Endelig justering og test er udført med en front overflade spejlglas slide mål. Laser magt er justeret til at give en mindstestørrelse ablation stedet (&lt;1um). Det ablation spot er centreret med fine justeringer af de sidste kinematically monteret spejl til trådkors fastsat i billedbehandling vinduet. Laser strøm til axotomy vil være ca 10 gange højere end nødvendigt for det minimale ablation spot på målet dias (dette kan variere med det mål, du bruger). Orme kan blive stående til laser axotomy og time-lapse imaging ved montering på agarose puder (eller i mikrofluide kamre 4). Agarose puder er nemt lavet med 10% agarose i balanceret saltvand smeltes i en mikrobølgeovn. En dråbe smeltet agarose er placeret på en glasplade og fladtrykte med en andenobjektglas i en pude cirka 200 um tyk (et enkelt lag af tid tape på tilstødende slides bruges som spacer). En &quot;Sharpie&quot; cap bruges til at skære en uniformeret diameter cirkulære pad på 13mm. Bedøvelse (1ul Muscimol 20mm) og Mikrokugler (Chris Fang-Yen personlig kommunikation) (1ul 2,65% Polystyren 0,1 um i vand) er føjet til midten af ​​puden fulgt med 3-5 orme orienteret, så de ligger på deres venstre side. Et dækglas finder anvendelse, og derefter Vaseline bruges til at forsegle dækglasset og forhindre fordampning af prøven.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy efterfulgt af time-lapse imaging er en følsom måde at analysere effekten af ​​mutationer i<em&gt; C. elegans</em&gt; På Axon regenerering. En høj kvalitet, men billig, kan laser-ablation systemet være let tilføjes til de fleste mikroskoper. Time Lapse billedbehandling over 15 timer kræver omhyggelig immobilisering af ormen.

Konstruktion af en low-budget Laser Axotomy System til Study Axon Regenerering i C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system til Studieinformationen Mechanotransduction i føtale lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple mikrofluidenheder for<em&gt; In vivo</em&gt; Scanning af<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Og zebrafisk

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Kvantitativ Locomotion Undersøgelse af Frit Svømning Mikroorganismer Brug laserdiffraktion

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Måling af Tension frigivelse i løbet Laser Induced Axon Læsion at evaluere axonale vedhæftning til underlaget ved Piconewton og millisekund

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Engineering 3D Cellularized kollagengeler for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System til Undersøg Chemotaxis i en 3D kollaqenmatrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Fremstilling af metal nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et værktøj til at studere de antibakterielle egenskaber ved nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...