Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation, der McKnight Endowment Fund for Neuroscience, der Christopher and Dana Reeve Foundation und Amerisure Charitable Foundation unterstützt.

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	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es gibt mehrere gute Gespräche von Laser-Mikrochirurgie mit verschiedenen Lasersystemen 3,5-11. Femtosekunden-IR-Laser sind der &quot;Goldstandard&quot; für die subzelluläre Laserablation 12 und praktisch, wenn mit einem bildgebenden Einrichtung verbunden sind, aber sie sind oft zu teuer für einzelne Benutzer. Wenn Sie ein Femtosekunden-IR-Laser für die Bildgebung Ihre Probe wegen der Tiefe der Bildgebung erfordern dann müssen Sie wahrscheinlich eine für Laser Axotomie. Transparente Gewebe mit Ziel Axone innerhalb von 30-50 um der Oberfläche sind wahrscheinlich machbar mit blauen und grünen Lasern in der 20 UJ / Pulsbereich durch eine hohe na Immersionslinse ausgerichtet. Es wird mehr Kollateralschäden mit der Nano-und Pikosekunden-Lasern im Vergleich mit dem Femtosekunden-Laser, zumal die Tiefe des Ziels Axon erhöht. C. elegans ist transparent und alle Axone sind innerhalb von 20-30 um von der Oberfläche. Wir routinemäßig geschnitten Motor Axone, die innerhalb von 5 um von der Oberfläche sind. Wir haben auch einfach Axtons in den Nerv Ring, der etwa 20 um von der Epidermis Oberfläche. Wir fanden das Limit für das Schneiden von Axonen zu etwa 30-50 um sein durch den Durchmesser eines erwachsenen Wurm. Es ist wahrscheinlich, dass die Laser-Ablation hier beschriebene System würde auch die Arbeit mit vielen verschiedenen Präparate, die den Kriterien der Transparenz und Tiefe der Ziel-Axone fit. Dennoch ist es ein wenig überraschend, da die theoretischen Vorteile der Femtosekunden-IR-Lasern, die Nano-und Pikosekunden 355 nm und 532 nm Laser durchführen, damit auch für Laser-Axotomie in C. elegans 6,13. Wir sehen keine Unterschiede in Axonregeneration in Reaktion auf Laser Axotomie mit Nanosekunden-440 nm, 532 nm Nanosekunden, und Femtosekunden-IR-Laser. Solid-State-355 nm UV-Laser sind über die gleichen Kosten wie der 532 nm diodengepumpte passiv Q-Switched Festkörperlaser, erfordern aber entweder höhere Mächte oder Optik, die effizient leiten diese kürzeren Wellenlängen. Die meisten Optiken sind für eine gute Leistung mit sichtbarem 400 -700 nm Licht. 355 nm-Laser anbieten würde einige Vorteile 6, wie reduzierte Plasma-Schwelle, kleiner Spot-Größe und einen langen Pass dichroitische wäre effizient direkte 100% der Abtragslaser zum Ziel und ermöglichen die gleichzeitige Darstellung von GFP ohne Verlust der Probe-Signal. Blau 440 nm Laser behielte die Vorteile der Arbeit mit einem sichtbaren Licht-Laser (gute Leistung mit Standard-Optik und Sicherheit). Leider sind die Kosten eines DPP Q-switched Festkörper 440 nm Laser-3-fache der Kosten einer 355nm oder 532 nm Laser mit ähnlicher Leistung zu diesem Zeitpunkt. Wenn wir entwarfen ein neues System für C elegans, wo Zieltiefe minimal ist, würden wir für eine UV-transparente Linse (Kosten über $ 3.000 für eine 40X 1.3na Öl-Objektiv mit 50-70% Transmission bei 355 nm) und einem 355 nm Laser produziert 5-10 UJ / Puls bei 1 opt -20 kHz. Axon-Ablation wird angenommen, dass aufgrund der Plasma-Formation. Kürzere Impulse werden Plasma-Schwellenwerte bei niedriger Leistung und der Plasma-Volumen w produzieren<html> krank werden, kleineren 6. Das Ziel ist, die kleinste und kurzlebigsten Plasma durch Anpassung der Pulsenergie auf den niedrigsten Energie zu erzeugen. Größere langlebige Plasmen erzeugt Kavitationsblasen, die Schäden umliegenden Zellen. Wir haben in der Regel, dass Ablation mit ca. 50-100 Impulse bei der höchsten Frequenz (dh 2,5 kHz) gefunden die besten Ergebnisse. Dies deutet darauf hin, dass Schäden kann schrittweise über eine Reihe von Impulsen, um eine bessere Kontrolle das Ausmaß der Schäden integriert werden. Die Laserablation hier beschriebene System ist sehr nachsichtig, wenn der Strahl ausgerichtet und erweitert genau. Wir beginnen Schneiden Axone bei erwachsenen Würmern bei 10% Laserleistung (durchschnittlich 0,3 mW gemessen bei 2500 Hz und schätzungsweise 1 UJ / Impuls) und kann mit begrenzten lokalen Beschädigungen bis 14% Stromausfall. Sie können größere Flächen von Schäden von 15 bis 39% Laserleistung zu beobachten, sondern nur über 40% Leistung (ca. 1 mW Durchschnitt bei 2500 Hz gemessen) nicht die Würmer explodieren durch große Kavitationsblasen und Schäden an der Wurm Nagelhaut. e_content &quot;&gt; Die Steinmeyer et al. 2010 2 Papier ist eine hervorragende Ressource für den Aufbau eines Laser-Ablation System. Leon Avery hat auch eine schöne praktische Beschreibung eines Laser-Ablation System auf einem günstigen N2-Gas 337 nm Laser basiert und er bietet einige große praktische Beratung (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Bei der Gestaltung Ihres eigenen Systems sollten Sie zuerst mit Ihrem Mikroskop zu reden, um festzustellen, wie die Abtragslaser zum Mikroskopobjektiv Ziel. Ihre Mikroskop auf einer Schwingungsisolierung Tisch montiert werden soll (Newport, TMI, Thor). Ein Steckbrett top ist optimal, aber eine solide Stahl-Spitze noch mit magnetischen Stellungsregler eingesetzt werden. Ein spezieller Zwischen-Modul auf einer aufrechten Rahmen ist schön, weil alle optischen Elemente an ihrem Platz gelassen werden können. Allerdings ist es kann billiger und bequemer, eine Kamera-Anschluss (invertiert) oder ein &quot;Kombinierer&quot; als Anhang einer epi-Fluoreszenz-Port zu verwenden. Sie müssen die Größe der hinteren Öffnung und die Durchlässigkeit kennen (in der a<html> blation Laserwellenlänge) des Objektivs die Sie verwenden möchten. Sobald Sie sich für einen Laser (zB CryLaS, TEEM, Crystal oder CRC), sollten Sie Thor oder Newport für die Hilfe bei der Auswahl der richtigen optischen Elementen, Hard-und Sicherheitseinrichtungen zu kontaktieren. Wir entschieden uns für ein duales galiläischen Beam Expander, um Platz zu sparen, sondern ein einfacher Kepler-Expander ist eine Option (F2/F1 = Ausdehnungskoeffizient). Eine benutzerdefinierte Beam Expander wird die am wenigsten teuer sein, aber Newport, Thor, und mehrere der Laser-Hersteller bieten hervorragende Qualität kommerziellen Beam Expander. Einige Laser-Hersteller bieten auch manuelle und elektronisch gesteuerte Dämpfer, die kostengünstig und platzsparend kann, aber nicht so vielseitig wie die Glan-Thompson-Polarisator und eine halbe Wellenlängen-Platte. Sie müssen auch entscheiden, wie mit dem Laser zu kontrollieren. Sie können eine LabView basierte Controller, einen kommerziellen TTL-Generator oder Software, die vom Laser-Unternehmen zur Verfügung gestellt. Diskutieren Sie die Optionen mit den spezifischen Laser-Hersteller. tent &quot;&gt; Wir haben eine Liste der Hardware haben wir nur als allgemeine Richtlinie verwendet werden, vorausgesetzt. Das hier beschriebene System kostet etwa 15.000 $, wenn unsere bestehenden Imaging-System aufgenommen. Ihr lokaler Physik-Abteilung wird oft jemand bereit ist, eine praktische Einführung in bieten sicher die Arbeit mit freien Strahl-Laser. Alternative Methoden zur Immobilisierung und Zeitraffer-Aufnahme von C. elegans wurden kürzlich beschrieben. 14 Fehlerbehebung Der schwierigste und entscheidende Schritt ist die Ausrichtung der zentrierten aufgeweitete Strahl auf die optische Achse des Mikroskops. Sobald Sie den Strahl zentriert und durch die Galilei-Objektiven arbeiten hart, um es an ausgerichtet innerhalb von 5 um des Mikroskops die optische Achse muss vor der Verwendung der Kippspiegel für die endgültige Ausrichtung des Zentrums erweitert. Häufiger Gebrauch der Kippspiegel, um den Strahl zu dem Mikroskop align verschiebt es ab Achse durch den StrahlExpander. mit äußerster Vorsicht kann man den Laserstrahl mit der entsprechenden ND-Filter dämpfen und direkt die Laserstrahl-Profil auf einem reflektierenden Ziel (Vorderseite Spiegel). Sie können sanft anstoßen dem Mikroskop genau Zentrum des Strahls in der 60X Ziel Sichtfeld (wenn sie nicht in die up / down Bandbreite Sie brauchen, um die Schiene höhenverstellbar zentriert). Das Strahlprofil kann zur präzisen Ausrichtung des Mikroskops optischen Achse zu einer zentrierten Strahl, der rund ist und &quot;Flares&quot; symmetrisch zu geben. Eine asymmetrische Flare ist ein Indiz dafür, dass das Mikroskop Achse nicht optimal ausgerichtet sind (oder die Schiene ist nicht Ebene). Schließlich sollten Sie einstellen L3 und sehen eine gleichmäßige und symmetrische Expansion und Kontraktion des Strahls. Fokus des Mikroskops genau auf der Zielfläche und passen Sie dann L3, um den Laserstrahl auf den kleinsten Punkt zu fokussieren. Sie sollten nun feststellen, dass der Laserstrahl innerhalb von 5 um des Zentrums ist es, wenn über LSCM oder CCD-System abgebildet und die Ablation Spot ist innerhalb von1um von Z konzentrieren. Wenn Sie feststellen, sind Sie &quot;sprengen&quot; Würmer oder konsequent Generierung großer Kavitationsblasen Axone Ihr Problem ist wahrscheinlich die Feinjustierung der Ablation Laser geschnitten. Achten Sie darauf, das Minimum (&lt;500nm) Ablation Ort, um die Z-Fokus (Einstellung der Konvergenz mit L3-Objektiv) und der XY Treuhand spot (Einstellung mit dem letzten kinematisch montierten Spiegel) lokalisiert ist. Targeting Axone näher an der Oberfläche wird weniger Laserleistung. Ebenso werden kleinere Tiere (L1 und L2) benötigen weniger Laserleistung für Axotomie gegenüber, die die gleichen Axone bei Erwachsenen. Wenn Ihr Wildtyp Axone nicht regenerieren oder die Axone Bleichmittel sollten Sie versuchen Reduzierung Bildgebung Laserleistung oder Verringerung der Abtastrate. Wenn Ihr Würmer sterben oder krank verringern Sie den Prozentsatz Agarose in 1%-Schritten. Achten Sie darauf, sich nicht bewegen das Deckglas nach der Montage Würmer wie diese verursachen oft wird sie zu sterben, wenn mit hohen Pro-Prozentpunkt Agarose und Mikrosphären. Wenn Ihr Würmer oder Burst während eines Time-Lapse-Sitzung sterben liegt es an: 1. Prozentsatz Agarose ist zu hoch. 2. Schäden an der Abtragslaser Nagelhaut. 3. Die Bewegung der Deckglas nach der Montage. Bei Schäden an der Nagelhaut ein Verschulden trifft es wirkt sich nur auf Montage Würmer, die mit dem Abtragslaser wurden gezielt. Wenn Ihr Wurm bewegt sich viel während eines Time-Lapse-Sitzung versuchen, den Anteil Agarose in 0,5% Schritten. Gesunde Axone in gesunde Würmer sind immer &quot;aktiv&quot; und Anzeige ein einheitliches Niveau der Fluoreszenz. Wenn Sie eine plötzliche Abnahme der Fluoreszenz oder der Tätigkeit zu sehen, wird der Wurm Sterbenden oder Toten. Mehrere Perlen oder fragmentiert Axone sind ein sicheres Zeichen für einen sterbenden oder toten Wurm. Wenn Sie Probleme mit Ihrer Axone im Fokus während der gesamten Zeitspanne Sitzung haben, kann es verschiedene Probleme. Prüfen Sie zunächst, Ihre Bühne Drift durch bildgebende einer inerten Probe auf einem Objektträger aus Glas über 10 hrs. Ein paar Mikrometer Drift kann durch thermische Instabilität, aber größer als 5 um liegt wahrscheinlich daran, mechanische Probleme mit Ihrem Mikroskop. Probleme mit Montage sind häufiger. Lassen Sie Ihre montiert Würmer mit Ihrem Mikroskoptisch Gleichgewicht für 30 Minuten, bevor Sie Ihren Zeitraffer. Prüfen Sie, ob Vaseline Dichtung nicht undicht werden im Laufe der Zeit verfallen Sitzung.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 535 nm Laser </td><td> CryLaS </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (TEEM, Crystal und CRC bieten auch vergleichbare Laser) </td></tr><tr><td> Alle Optiken und Hardware </td><td></td><td></td><td> (Thor bietet vergleichbare Optik und Hardware) </td></tr><tr><td> SUPREMA Optical Mount, 1,0-Durchmesser </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Durchmesser von 1 &quot;post, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Durchmesser von 1 &quot;post Gabel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Achromatische Zero-Order Wavel Plate, ½ Welle Retardierung, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotation Stage, 1 &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Durchmesser von 1 &quot;post, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Durchmesser von 1 &quot;post Gabel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Calcit Polarisator, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarizer Rotation Berg </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;Abstandhalter für Durchmesser von 1&quot; post </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;Höhe, Durchmesser von 1&quot; post </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork, 1 &quot;Durchmesser Beitrag </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breite Dump </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Mikroskopobjektivs Berg </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Durchmesser von 1 &quot;post, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Durchmesser von 1 &quot;post Gabel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG Laser Mirror, 25,4 mm Durchmesser, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA Optical Mount, 1,0 Zoll Durchmesser, Abstand Montagebohrung </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> High Precision Knob Einstellschraube, 12,7 reisen, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Gewindeadapter, ¼ -20 männlich, 8-32 weiblich </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Clamp für 1,5-Zoll-Durchmesser-Stab </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 Zoll (35,5 cm) hoch </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Schiene Träger für X26, quadratisch 40mm Länge </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) Länge </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rod Plattform für 1,5-Zoll-Durchmesser-Stab </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 Zoll (35,5 cm) hoch </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plankonkavlinse, 12,7 mm Durchmesser, 25 mm-EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plankonvexlinse, 25,4 mm Durchmesser, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plankonvexlinse, 25,4 mm Durchmesser, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Objektiv mit fester Brennweite Mount, 0,5 &quot;Durchmesser, 1,0&quot; Axis Höhe </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Objektiv mit fester Brennweite Mount, 1,0 &quot;Durchmesser, 1,0&quot; Axis Höhe </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microspheres 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EBO-Angelegenheiten </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser Axotomie von Zeitraffer-Mikroskopie folgte, ist eine sensitive Assay für Axonregeneration Phänotypen in C. elegans 1. Die größte Schwierigkeit dieses Tests ist die wahrgenommenen Kosten ($ 25-100K) und technisches Know-how für die Implementierung eines Laser-Ablation System 2,3 notwendig. Allerdings können Solid-State-Puls-Laser mit bescheidenen Kosten (&lt;$ 10K) bieten robuste Leistung für Laser-Ablation in transparent Zubereitungen, Ziel Axone sind &quot;nahe&quot; an der Gewebeoberfläche. Aufbau und Abgleich eines Systems kann in einem Tag erreicht werden. Der Strahlengang wird durch Licht aus dem Fokus Kondensator zur Abtragslaser versehen bietet eine praktische Ausrichtung zu führen. Eine Zwischenschicht-Modul mit allen Optiken entfernt werden, um die Abtragslaser gewidmet sein und versichert, dass keine optischen Elemente während einer Laser-Ablation-Sitzung müssen verschoben werden. Ein dichroitischer in der Zwischen-Modul ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung und Laserablation. Zentrieren des Laserstrahls to ausgehenden Strahl aus dem fokussierten Mikroskop Kondensorlinse führt die anfängliche Ausrichtung des Systems. Eine Vielzahl von Linsen sind zur Konditionierung eingesetzt und erweitern Sie den Laserstrahl auf die Rückseite Apertur des Objektivs gewählt zu füllen. Endgültige Ausrichtung und die Prüfung erfolgt mit einer Stirnfläche verspiegeltem Glas gleiten Ziel durchgeführt. Laserleistung wird angepasst, um eine Mindestgröße Ablation spot (&lt;1um) geben. Die Ablation Spot ist mit leichten Korrekturen der letzten kinematisch montierten Spiegel die Haare in der Imaging-Fenster fest Kreuz zentriert. Laserleistung für Axotomie werden ca. 10x höher als für die minimale Abtragung Fleck auf der Ziel-Rutsche (dies kann mit dem Ziel, das Sie variiert je nach Nutzung) benötigt werden. Worms kann für die Laser-Axotomie und Zeitraffer-Bildgebung durch die Montage auf Agarose-Pads (oder in mikrofluidischen Kammern 4) immobilisiert werden. Agarose-Pads lassen sich leicht mit 10% Agarose in ausgewogener Salzlösung in der Mikrowelle geschmolzen gemacht. Ein Tropfen geschmolzenen Agarose wird auf eine Glasplatte gelegt und abgeflacht mit einem anderenGlasträger in einem Pad ca. 200 um dick (eine einzelne Schicht aus der Zeit Band auf benachbarten Folien ist als Abstandhalter verwendet werden). A &quot;Sharpie&quot; cap dient zum Ausschneiden eines uniformierten Durchmesser runde Pad von 13mm. Betäubungsmittel (1UL Muscimol 20mm) und Microspheres (Chris Fang-Yen persönliche Mitteilung) (1UL 2,65% Polystyrol 0,1 um in Wasser) in die Mitte des Pads um 3-5 Würmer orientierten gefolgt, so dass sie auf ihrer linken Seite liegende hinzugefügt werden. Ein Deckglas aufgebracht wird und dann Vaseline wird verwendet, um das Deckglas versiegeln und verhindern Verdampfung der Probe.

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Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser Axotomie gefolgt von Zeitraffer-Imaging ist eine sensible Art und Weise zum Testen der Auswirkungen von Mutationen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Auf Axonregeneration. Eine hochwertige, aber preiswerte, kann Laser-Ablation System problemlos an die meisten Mikroskope hinzugefügt werden. Zeitraffer-Aufnahme mehr als 15 Stunden erfordert eine sorgfältige Immobilisierung des Wurms.

Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

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Forschung

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