Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע, הקרן מק &#39;נייט קרן Neuroscience, כריסטופר ודנה ריב קרן קרן Amerisure הצדקה.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנם מספר דיונים טובה של לייזר microsurgery עם מערכות לייזר שונות 3,5-11. Femtosecond לייזרים IR הם &quot;תקן הזהב&quot; עבור אבלציה לייזר subcellular 12 ונוחה אם הקשורים במתקן הדמיה, אבל הם לעיתים קרובות יקר מדי עבור משתמשים פרטיים. אם אתם זקוקים לייזר femtosecond IR עבור הדמיה מדגם שלך בגלל עומק הדמיה אז אתה כנראה צריך אחד עבור לייזר axotomy. רקמות שקוף עם אקסונים היעד בתוך 30-50 אממ של פני השטח הם כנראה אפשרי עם לייזרים הדופק כחול וירוק בטווח Uj / דופק 20 ממוקדות מבעד לעדשה na גבוה טבילה. לא יהיה נזק סביבתי יותר עם ​​ננו ולייזרים פיקו second לעומת הלייזר femtosecond, במיוחד כאשר העומק של עליות האקסון היעד. ג elegans שקוף אקסונים כולם בתוך 20-30 אממ של פני השטח. אנו שגרתי לחתוך אקסונים מנוע, כי הם בתוך 5 אממ של פני השטח. יש לנו גם לחתוך בקלות גרזןתוספות בתוך טבעת העצב כי הם בערך 20 אממ מפני השטח לציפורן. מצאנו את מגבלת לחיתוך אקסונים להיות כ 30-50 אממ דרך בקוטר של תולעת מבוגר. סביר להניח כי אבלציה לייזר במערכת המתואר כאן יעבוד היטב עם תכשירים שונים שמתאימים לקריטריונים של שקיפות ועומק של אקסונים היעד. ובכל זאת, זה קצת מפתיע, בהתחשב ביתרונות התיאורטיים של לייזרים femtosecond IR, כי ננו picosecond 355 nm ו 532 nm לייזרים לבצע כל כך טוב עבור לייזר axotomy ב C. elegans 6,13. אנו רואים הבדלים התחדשות האקסון בתגובה לייזר axotomy שבריר שנייה עם 440 ננומטר, 532 ננומטר שבריר שנייה, לייזרים femtosecond IR. מצב מוצק 355 ננומטר לייזרים UV הן על העלות זהה דיודה 532 ננומטר שאוב פסיבי Q-Switched לייזר מצב מוצק, אך דורשים סמכויות או גבוה או אופטיקה ביעילות לעבור אלה אורכי גל קצרים יותר. רוב אופטיקה נועדו לבצע היטב עם 400 גלוי -700 ננומטר אור. 355 ננומטר לייזרים תציע כמה יתרונות כגון 6 סף פלזמה מופחת, גודל נקודה קטן יותר, dichroic לעבור זמן רב היה יעיל ישיר 100% של הלייזר אבלציה ליעד ולאפשר דימות סימולטני של ה-GFP ללא אובדן האות המדגם. כחול 440 ננומטר לייזרים היה לשמר את היתרונות של עבודה עם לייזר האור הנראה (ביצועים טובים עם אופטיקה תקן בטיחות). למרבה הצער, את העלות של DPP Q-switched מוצק המדינה 440 ננומטר לייזר 3 פעמים את העלות של לייזר 355nm או 532 ננומטר עוצמה דומה בתקופה זו. אם היינו בתכנון מערכת חדשה עבור C. elegans, שם בעומק המטרה היא מינימלית, היינו לבחור עדשה שקופה UV (עלות כ - 3000 $ עבור עדשה שמן 40X 1.3na עם העברה 50-70% ב 355nm) ו לייזר 355 ננומטר לייצור Uj 5-10 / דופק על 1 -20 קילוהרץ. אבלציה אקסון נחשבת עקב היווצרות פלזמה. פולסים קצרים יפיק ספי פלזמה ב חשמל נמוכה הכרכים פלזמה w<html> חולה להיות קטן 6. המטרה היא לייצר את הפלזמה הקטן משך החיים הקצר ביותר על ידי התאמת אנרגיה הדופק העוצמה הנמוכה ביותר. מוגדלת חיים ארוכים פלזמות תיצור בועות cavitation כי נזק לתאים הסמוכים. גילינו בדרך כלל כי אבלציה באמצעות כ 50-100 פעימות בתדירות הגבוהה ביותר (כלומר 2.5kHz) נותן את התוצאות הטובות ביותר. הדבר מצביע על כך הנזק ניתן לשלב בהדרגה במשך סדרה של פולסים לשלוט טוב יותר את מידת הנזק. אבלציה לייזר המערכת המתוארת כאן היא סלחנית מאוד אם קרן מיושר והרחיב במדויק. אנחנו מתחילים חיתוך האקסונים של תולעים בוגרות לייזר בהספק 10% (ממוצע של 0.3 mW נמדד ב הרץ 2500 והעריך 1 Uj / דופק) והוא יכול לחתוך עם נזק מקומי מוגבל באמצעות כוח 14%. אתה יכול לראות אזורים גדולים של נזק מהשלטון לייזר 15-39%, אבל רק מעל כוח 40% (כ 1 ממוצע mW נמדד הרץ 2500) לעשות התולעים להתפוצץ עקב בועות cavitation גדול ונזק לציפורן של התולעת. e_content &quot;&gt; et al. 2010 2 הנייר הוא משאב מצוין עבור בניית מערכת אבלציה לייזר. Steinmeyer ליאון אייברי יש גם תיאור מעשי נחמד של מערכת לייזר אבלציה מבוסס על לייזר זול גז N2 337 ננומטר והוא מספק כמה מעשית רבה עצה (elegans.swmed.edu / Worm_labs / אייברי /). בעת תכנון המערכת שלך אתה צריך קודם לדבר עם נציג מיקרוסקופ כדי לקבוע כיצד לכוון את הלייזר אבלציה למטרה מיקרוסקופ. מיקרוסקופ שלך צריך להיות מותקן על שולחן בידוד רעידות (ניופורט, TMI, Thor). גבי קרש החיתוך הוא אופטימלי, אבל בראש פלדה מוצק עדיין ניתן להשתמש עם positioners מגנטי. מודול ייעודי ביניים על היקף זקופה נחמד כי כל אלמנטים אופטיים ניתן להשאיר במקום. עם זאת, יכול להיות זול יותר ונוח יותר להשתמש ביציאת המצלמה (הפוכה) או &quot;combiner&quot; שמחוברים ליציאת עלית פלורסנט. אתה צריך לדעת את גודל הצמצם האחורי לבין העברה (ב<html> blation לייזר באורך גל) של העדשה אובייקטיבי אתה מתכוון להשתמש. ברגע שאתה מחליט על לייזר (למשל, Crylas, לשרוץ, קריסטל, או CRC) אתה צריך ליצור קשר תור או ניופורט לעזרה עם בחירת אלמנטים אופטיים נכונה, ציוד חומרה ובטיחות. החלטנו על ההרחבה הקורה הכפולה גלילי כדי לחסוך מקום, אלא פשוט קפלרי ההרחבה היא אופציה (f2/f1 = גורם הרחבה). ההרחבה קרן אישית יהיה הכי זול, אבל בניופורט, Thor, וכמה יצרני לייזר להציע איכות מעולה מסחרי הקורה expanders. חלק מהיצרנים מציעים גם לייזר attenuators ידני מבוקר אלקטרונית שעשויים להיות העלות האפקטיבית לחסוך מקום, אבל לא תכליתי כמו מקטב Glan-תומפסון ואת גל צלחת וחצי. אתה גם צריך להחליט כיצד לשלוט על לייזר. באפשרותך לעצב בקר LabVIEW מבוסס, להשתמש במחולל מסחרי TTL, או תוכנה המסופקים על ידי החברה לייזר. דונו באפשרויות עם היצרן לייזר ספציפי. אוהל &quot;&gt; סיפקנו רשימה של החומרה השתמשנו רק כהנחיה כללית. המערכת המתוארת כאן עולה על 15,000 $ כאשר הוסיף מערכת ההדמיה הקיימים שלנו. המחלקה לפיסיקה המקומי שלך לעתים קרובות יהיה מישהו מוכן לתת הקדמה מעשית בבטחה לעבוד עם אלומת לייזרים חינם. שיטות חלופיות immobilization זמן לשגות הדמיה של C. elegans תוארו לאחרונה. 14 פתרון בעיות השלב הקשה ביותר והקריטי הוא יישור של הקורה מורחבת במרכז לציר האופטי של המיקרוסקופ. ברגע שיש לך את אלומת האור ממוקדת והרחיב דרך עדשות הגלילי אתה צריך לעבוד קשה כדי לקבל את זה מיושר בתוך 5 אממ של ציר אופטי של מיקרוסקופ לפני תחילת השימוש במראות ההיגוי יישור הסופי למרכז. שימוש מוגזם המראות היגוי כדי ליישר את הקורה המיקרוסקופ יעברו דרך אותו ציר הקורהההרחבה. שימוש בזהירות רבה אתה יכול להחליש את קרן הלייזר עם מסנן ND המתאים להציג ישירות את פרופיל קרן לייזר על מטרה רפלקטיבית (ראי פני השטח הקדמי). אתה יכול לנדנד בעדינות את המיקרוסקופ למרכז בדיוק את הקורה בתחום 60x המטרה של התצוגה (אם זה לא יכול להיות מרוכז בטווח למעלה למטה / אתה צריך להתאים את גובה המעקה). פרופיל קרן יכול לשמש בדיוק ליישר את ציר מיקרוסקופ אופטי לתת קרן ממוקדת כי הוא עגול &quot;התפרצויות&quot; סימטרי. התלקחות אסימטרית הוא אינדיקציה לכך את ציר מיקרוסקופ אינו מיושר לחלוטין (או המעקה לא ברמה). לבסוף, אתה צריך להתאים L3 ולראות הרחבה אפילו סימטרי והתכווצות של הקורה. פוקוס מיקרוסקופ דווקא על משטח היעד ולאחר מכן להתאים L3 למקד את קרן הלייזר למקום הקטן. כעת אתה אמור למצוא את קרן הלייזר נמצא במרחק 5 אממ המרכז כאשר צילמו באמצעות LSCM או CCD מערכת הנקודה נמצאת בתוך אבלציה1um של המוקד Z. אם אתה מוצא שאתה &quot;לפוצץ&quot; תולעים או באופן עקבי לייצר בועות cavitation גדול לחתוך אקסונים הבעיה שלך היא ככל הנראה את יישור קנס של הלייזר אבלציה. ודא המינימום (&lt;500nm) במקום אבלציה הוא מקומי למקד את Z (להתאים את ההתכנסות עם עדשה L3) וכן למקום XY נאמנות (להתאים עם מראה רכוב kinematically אחרון). מיקוד אקסונים קרוב לפני השטח ידרוש פחות כוח לייזר. באופן דומה, בעלי חיים קטנים (L1 ו-L2) ידרוש פחות כוח לייזר axotomy לעומת מיקוד אקסונים זהה אצל מבוגרים. אם אקסונים בר שלך סוג לא להתחדש או אקונומיקה אקסונים אתה צריך לנסות לצמצם כוח הדמיה לייזר או להקטין את קצב הדגימה. אם תולעים שלך למות או להיות חולני לנסות לצמצם את אחוז agarose בשלבים 1%. ודא שאתה לא העברת coverslip אחרי תולעים הרכבה כמו זה יהיה לעיתים קרובות לגרום להם למות בעת שימוש גבוה לכלcentage agarose ו microspheres. אם תולעים שלך להתפוצץ או למות במהלך הפגישה זמן לשגות זה בגלל: 1. אחוז agarose הוא גבוה מדי. 2. נזק לציפורן על ידי לייזר אבלציה. 3. תנועת coverslip לאחר הרכבה. אם נזק לציפורן הוא אשם זה ישפיע רק על תולעים רכוב כי כבר ממוקד עם לייזר אבלציה. אם התולעת שלך נעה יותר מדי במהלך הפגישה זמן לשגות נסה להגדיל את אחוז agarose בצעדים 0.5%. אקסונים בריאה תולעים בריא הם תמיד &quot;פעיל&quot; ולהציג רמה עקבית של הקרינה. אם אתה רואה ירידה פתאומית פלואורסצנטי או פעילות התולעת גוסס או מת. אקסונים חרוזים או מקוטעת מרובות הן סימן בטוח של תולעת גוסס או מת. אם אתה מתקשה לשמור על אקסונים שלך בפוקוס במהלך הפגישה כל הזמן לשגות ייתכנו בעיות שונות. ראשית לבדוק להיסחף הבמה שלך על ידי הדמיה מדגם אינרטי בשקופית זכוכית מעל 10 שעותrs. להיסחף מיקרון כמה יכול להיות בגלל חוסר יציבות תרמית, אבל יותר מ -5 אממ כנראה בשל בעיות מכניות עם מיקרוסקופ שלך. בעיות עם הרכבה שכיחים יותר. בואו תולעים רכוב שלך לאזן עם מיקרוסקופ הבמה שלך במשך 30 דקות לפני תחילת זמן לשגות שלך. בדוק חותם וזלין שלך לא לפתח דליפות במהלך ההפעלה זמן לשגות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> 535 ננומטר לייזר </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (לשרוץ, קריסטל, ו CRC מציעים גם לייזרים מקביל) </td></tr><tr><td> כל אופטיקה וחומרה </td><td></td><td></td><td> (Thor מציעה אופטיקה דומה וחומרה) </td></tr><tr><td> SUPREMA אופטי הר, 1.0-בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט בקוטר 1&quot; גובה </td><td> ניופורט </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט קוטר המזלג </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> אכרומטי Zero-Order פלייט Wavel, ½ גל פיגור, 400-700nm </td><td> ניופורט </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> שלב סיבוב, 1 &quot;Aperature </td><td> ניופורט </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט בקוטר 1&quot; גובה </td><td> ניופורט </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט קוטר המזלג </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-לייזר מקטב קלציט, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> סיבוב מקטב הר </td><td> ניופורט </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;spacer עבור 1&quot; פוסט בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;גובה, 1&quot; פוסט בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> פורק, 1 &quot;פוסט בקוטר </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> קרן Dump </td><td> ניופורט </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> המטרה עדשה מיקרוסקופ הר </td><td> ניופורט </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט בקוטר 1&quot; גובה </td><td> ניופורט </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;פוסט קוטר המזלג </td><td> ניופורט </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG לייזר מראה, קוטר 25.4 מ&quot;מ, 45 °, 532 ננומטר </td><td> ניופורט </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA אופטי הר, בקוטר 1.0 אינץ&#39;, חור אישור הרכבה </td><td> ניופורט </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> דיוק גבוהה Knob בורג כוונון, נסיעות 12.7mm, 100TPI </td><td> ניופורט </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> מתאם נושא, ¼ זכר -20, 8-32 נקבה </td><td> ניופורט </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> רוד קלאמפ עבור מוט בקוטר 1.5 אינטש </td><td> ניופורט </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> רוד, 14 אינץ&#39; (35.5 ס&quot;מ) גבוה </td><td> ניופורט </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Rail המוביל לכל אורך x26 רבועים, 40mm </td><td> ניופורט </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) אורך </td><td> ניופורט </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> רוד פלטפורמה עבור מוט בקוטר 1.5 אינטש </td><td> ניופורט </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> רוד, 14 אינץ&#39; (35.5 ס&quot;מ) גבוה </td><td> ניופורט </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-עדשה קעורה, בקוטר 12.7mm, 25mm-EFL, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-עדשה קמורה, בקוטר 25.4mm, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-עדשה קמורה, בקוטר 25.4mm, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> ניופורט </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> עדשה קבועה בהר, 0.5 &quot;, בקוטר 1.0&quot; גובה הציר </td><td> ניופורט </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> עדשה קבועה בהר, 1.0 &quot;קוטר, 1.0&quot; גובה הציר </td><td> ניופורט </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Microspheres 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO בעניינים </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> סיגמא </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

לייזר axotomy ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות הוא assay רגיש פנוטיפים האקסון התחדשות ב C. elegans 1. הקושי העיקרי של assay זה היא העלות נתפס ($ 25-100K) ואת המומחיות הטכנית הנדרשת ליישום אבלציה לייזר מערכת 2,3. עם זאת, המדינה לייזר מוצק הדופק של עלויות צנוע (&lt;$ 10K) יכול לספק ביצועים חזקים עבור אבלציה לייזר בהכנות שקוף שבו האקסונים היעד &quot;לסגור&quot; על פני השטח רקמות. בנייה ויישור של המערכת יכול להתבצע ביום אחד. הנתיב האופטי המסופק על ידי אור הקבל ממוקד לייזר אבלציה מספק מדריך יישור נוח. מודול ביניים עם כל אופטיקה הסיר ניתן המוקדש לייזר אבלציה ומבטיחה שאין אלמנטים אופטיים צריך להתרגש במהלך הפגישה אבלציה לייזר. Dichroic במודול ביניים מאפשר הדמיה סימולטני אבלציה לייזר. מרכוז קרן הלייזר לאo קרן היוצאת מן עדשה מיקרוסקופ ממוקד הקבל מנחה את היישור ההתחלתי של המערכת. מגוון של עדשות משמשים תנאי ולהרחיב את קרן הלייזר כדי למלא את הפתח האחורי של העדשה המטרה שנבחרה. יישור בדיקות הסופי מתבצע עם יעד משטח מול מראות זכוכית שקופית. כוח לייזר מותאם לתת הגודל המינימלי אבלציה נקודה (&lt;1um). נקודה אבלציה מרוכז עם התאמות בסדר המראה רכוב kinematically האחרון לחצות שערות קבוע בחלון ההדמיה. לייזר כוח axotomy יהיה 10X כ גבוה יותר מאשר צורך במקום אבלציה המינימום בשקופית היעד (זה עשוי להשתנות עם יעד אתה משתמש). תולעים יכולים להיות משותקת עבור לייזר ו axotomy זמן לשגות הדמיה על ידי הרכבה על כריות agarose (או microfluidic לתאי 4). רפידות agarose נעשים בקלות מלוחים מאוזנת נמס במיקרוגל עם agarose 10%. ירידה של agarose מותכת מושם על שקופית זכוכית שטוחה עם אחרשקופיות הזכוכית לתוך כרית כ 200 אממ עבה (שכבה יחידה של קלטת זמן בשקופיות הסמוך משמש כשומר רווח). &quot;ממולח&quot; כובע משמש לגזור משטח עגול בקוטר במדים של 13mm. הרדמה (1ul Muscimol 20mm) ו microspheres (כריס פאנג-ין תקשורת אישית) (1ul 2.65% פוליסטירן 0.1 אממ במים) מתווספים במרכז כרית ואחריו 3-5 תולעים אוריינטציה כך שהם שוכבים על הצד השמאלי שלהם. Coverslip כוס מוחל ואז וזלין משמש לאטום את coverslip ולמנוע התאדות של המדגם.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

לייזר axotomy ואחריו הדמיה זמן לשגות היא דרך רגיש assay את ההשפעות של מוטציות<em&gt; ג elegans</em&gt; על התחדשות האקסון. איכות גבוהה, אבל זול, מערכת לייזר אבלציה ניתן להוסיף בקלות לרוב מיקרוסקופים. זמן לשגות הדמיה מעל 15 שעות מחייבת immobilization זהיר של התולעת.

בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

מחקר נידות כמותית של חי מייקרו אורגניזמים בחופשיות באמצעות ליזר עקיף

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...