Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation, McKnight Endowment Fund for Neuroscience, er Christopher og Dana Reeve Foundation og Amerisure Charitable Foundation.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Det finnes flere gode diskusjoner av laser mikrokirurgi med forskjellige laser systemer 3,5-11. Femtosecond IR lasere er &quot;gullstandarden&quot; for subcellular laser ablasjon 12 og praktisk hvis forbundet med en avbildning anlegg, men de er ofte for kostbare for individuelle brukere. Hvis du trenger en femtosecond IR laser for imaging prøven på grunn av dybden av bildebehandling vil du sannsynligvis trenger en for laser axotomy. Transparent vev med target axons innen 30-50 um av overflaten er trolig gjennomførbart med blå og grønne puls lasere i de 20 UJ / puls utvalg målrettet gjennom en høy na nedsenking linse. Det vil være mer collateral damage med nano og pico andre lasere sammenlignet med femtosecond laser, særlig når dybden av målet aksonet øker. C. elegans er gjennomsiktig og alle axons er innenfor 20-30 um av overflaten. Vi rutinemessig kutte motor axoner som er innen 5 um av overflaten. Vi har også lett kutte øksons innenfor nerve ring som er rundt 20 um fra cuticle overflaten. Vi fant grensen for å kutte axons å være om lag 30-50 um gjennom diameter av en voksen orm. Det er sannsynlig at laser ablasjon systemet beskrevet her ville fungere bra med mange forskjellige preparater som passer kriteriene for åpenhet og dybde av målet axoner. Likevel er det litt overraskende, gitt den teoretiske fordelene av femtosecond IR lasere, som nano og picosecond 355 nm og 532 nm lasere gjøre så godt for laser axotomy i C. elegans 6,13. Vi ser ingen forskjeller i axon regenerering svar på laser axotomy med nanosekund 440 nm, nanosekund 532 nm, og femtosecond IR lasere. Solid state 355 nm UV lasere er omtrent samme pris som det 532 nm diode pumpet passivt Q-Switched solid state laser, men krever enten høyere makter eller optikk som effektivt passerer disse kortere bølgelengder. De fleste optikk er konstruert for å gjøre det bra med synlig 400 -700 nm lys. 355 nm lasere ville tilby noen fordeler 6 som redusert plasma terskel, mindre flekk størrelse, og en langpasning dichroic ville effektivt direkte 100% av ablasjon laser til målet og la samtidig avbildning av GFP uten tap av prøve signal. Blå 440 nm lasere ville beholde fordelene med å jobbe med en synlig lys laser (god ytelse med standard optikk og sikkerhet). Dessverre er prisen av en DPP Q-switched solid state 440 nm laser 3 ganger kostnaden for en 355nm eller 532 nm laser av lignende kraft på dette tidspunktet. Hvis vi skulle designe et nytt system for C. elegans, hvor target dybde er minimal, ville vi velge en UV gjennomsiktig linse (koster ca kr 3000 for en 40X 1.3na olje-objektiv med 50-70% transmisjon på 355nm) og en 355 nm laser produsere 50-10 UJ / puls ved 1 -20 kHz. Axon ablasjon antas å skyldes plasma formasjon. Kortere pulser vil produsere plasma terskler ved lavere makt og plasma volum w<html> syke bli mindre 6. Målet er å produsere den minste og korteste levetid plasma ved å justere puls energi til laveste styrkenivå. Større langlivede plasmaer vil generere kavitasjon bobler som skader omkringliggende celler. Vi har generelt funnet ut at ablasjon bruker ca 50-100 pulser på høyeste frekvens (dvs. 2.5kHz) gir de beste resultatene. Dette tyder på at skaden kan bli gradvis integrert over en rekke pulser til bedre kontroll omfanget av skaden. Den laser ablasjon system som beskrives her er veldig tilgivende hvis strålen er justert og utvidet nøyaktig. Vi starter å kutte axoner i voksen ormer ved 10% laser kraft (snitt på 0,3 mW målt ved 2500 Hz og anslagsvis 1 UJ / puls) og kan kutte med begrenset lokaliserte skader gjennom 14% strøm. Du kan observere større områder av skader 15-39% laser makt, men bare over 40% kraft (ca 1 mW gjennomsnittlig målt ved 2500 Hz) eksplodere ormer gjøre på grunn av store kavitasjon bobler og skader ormen i skjellaget. e_content &quot;&gt; The Steinmeyer et al. 2010 2 papir er en utmerket ressurs for å konstruere en laser ablasjon system. Leon Avery har også en fin praktisk beskrivelse av en laser ablasjon system basert på en rimelig N2 gass 337 nm laser og han gir noen stor praktisk råd (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Når designe ditt eget system, bør du først snakke med dine mikroskop representant for å finne ut hvordan å målrette ablasjon laser til mikroskopet målet. Din mikroskop bør monteres på en vibrasjonsisolering bord (Newport, TMI, Thor). En breadboard toppen er optimal, men en solid stål toppen kan fortsatt brukes med magnetisk posisjoneringsenheter. En dedikert mellomliggende modul på en opprettstående omfang er fint fordi alle optiske elementer kan bli liggende på plass. Men det kan være billigere og mer praktisk å bruke et kamera port (invertert) eller en &quot;combiner&quot; festet til en epi-fluorescerende port. Du trenger å vite størrelsen på ryggen blenderåpning og transmittans (på en<html> blation laser bølgelengde) av objektiv du har tenkt å bruke. Når du bestemmer deg på en laser (f.eks Crylas, vrimle, Crystal, eller CRC) bør du kontakte Thor eller Newport for hjelp med å velge riktig optiske elementer, maskinvare og sikkerhetsutstyr. Vi bestemte oss på en dual galileer stråle ekspander for å spare plass, men en enklere Keplerian Expander er et alternativ (f2/f1 = utvidelse faktor). En tilpasset bjelke ekspander vil være den minst kostbare, men Newport, Thor, og flere av laser produsenter tilbyr utmerket kvalitet kommersielle bjelke expanders. Noen laser produsenter tilbyr også manuell og elektronisk styrte lyddempere som kan være kostnadseffektive og plassbesparende, men ikke like allsidig som Glan-Thompson polarisator og halv bølge plate. Du må også bestemme hvordan å kontrollere laser. Du kan utforme en LabView basert controller, bruke en kommersiell TTL generator, eller programvare som leveres av laser selskapet. Diskuter alternativer med de spesifikke laser produsenten. telt &quot;&gt; Vi har laget en liste over maskinvaren vi har bare brukes som en generell veiledning. Systemet er beskrevet her koster ca $ 15 000 da lagt til vår eksisterende imaging system. Din lokale Physics avdeling vil ofte ha noen villige til å gi en praktisk innføring i trygt å jobbe med gratis bjelke lasere. Alternative metoder for immobilisering og tidsinnstilte avbildning av C. elegans har nylig blitt beskrevet. 14 Feilsøking De vanskeligste og mest kritiske trinnet er justeringen av sentrert utvidet strålen til den optiske aksen av mikroskopet. Når du har strålen sentrert og utvidet gjennom galileiske linser bør du jobbe hardt for å få det justert til innen 5 um av mikroskopet optiske aksen FØR du bruker styringen speil for den endelige justering til sentrum. Overdreven bruk av styringsgruppen speil for å justere strålen til mikroskopet vil flytte den av aksen gjennom strålenekspander. BRUK EXTREME FORSIKTIG du kan dempe laserstrålen med passende ND filter og direkte se laserstrålen profil på en reflekterende mål (foran overflate mirror). Du kan skubber mikroskopet til nettopp sentrum strålen i 60X objektiv synsfelt (hvis det ikke kan være sentrert i opp / ned området du trenger å justere rail høyde). Strålen profilen kan brukes til nøyaktig justere mikroskop optiske aksen for å gi en sentrert stråle som er sirkulær og &quot;flares&quot; symmetrisk. En asymmetrisk bluss er en indikasjon på at mikroskop aksen ikke er perfekt justert (eller jernbane er ikke nivået). Til slutt bør du justere L3 og se en jevn og symmetrisk ekspansjon og sammentrekning av strålen. Fokus mikroskopet nøyaktig på målet overflaten og deretter justere L3 å fokusere laserstrålen til den minste flekk. Du skal nå finne at laserstrålen er innen 5 um av senteret når avbildes via LSCM eller CCD-systemet og ablasjon stedet er innenfor1um av Z fokus. Hvis du synes du er &quot;blåse opp&quot; ormer eller konsekvent generere store kavitasjon bobler å kutte axons problemet ditt er mest sannsynlig den fine justering av ablasjon laser. Pass på minimum (&lt;500nm) ablasjon spot er lokalisert til Z fokus (justere konvergens med L3 objektiv) og til XY tillitspersonen flekken (juster med siste kinematically montert speil). Targeting axons nærmere overflaten vil kreve mindre laser makt. Tilsvarende vil mindre dyr (L1 og L2) krever mindre laser strøm for axotomy forhold til målgruppe samme axons hos voksne. Hvis villtype axons ikke regenerere eller axons blekemiddel du bør prøve å redusere avbildning laser makt eller redusere sampling rate. Hvis ormer dø eller bli sykelig prøve å redusere prosent agarose i trinn på 1%. Pass på at du ikke flytter dekkglass etter montering ormer som dette vil ofte føre dem til å dø når du bruker høy perandelen agarose og mikrosfærer. Hvis ormer briste eller dø i løpet av en time-lapse session det skyldes: 1. Prosentandel agarose er for høy. 2. Skade på cuticle ved ablasjon laser. 3. Bevegelse av dekkglass etter montering. Dersom skader på skjellaget er feil det vil bare påvirke montert ormer som har vært målrettet med ablasjon laser. Hvis orm beveger seg for mye under en time-lapse session prøve å øke andelen agarose i 0,5% trinn. Sunn axoner i sunne ormer er alltid &quot;aktiv&quot; og viser en konsistent nivå av fluorescens. Hvis du ser en plutselig reduksjon i fluorescens eller aktivitet ormen er døende eller døde. Flere beaded eller fragmentert axons er et sikkert tegn på en døende eller døde ormen. Hvis du har problemer med å holde dine axoner i fokus under hele tiden lapse session det kan være flere ulike problemer. Først sjekke din scenen drift av tenkelig en inert prøven på en glass-slide over 10 hrs. Et par mikrometer drift kan skyldes termisk ustabilitet, men større enn 5 um skyldes sannsynligvis til mekaniske problemer med mikroskop din. Problemer med montering er mer vanlig. La montert ormer likevekt med mikroskop scenen i 30 minutter før du starter din tid forfalle. Kontroller at vaselin forseglingen ikke utviklet lekkasjer i løpet av din tid forfalle økten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Navn på reagens </th><th> Firma </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (valgfritt) </th></tr><tr><td> 535 nm laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (Vrimle, Crystal, og CRC tilbyr også sammenlignbare lasere) </td></tr><tr><td> All optikk og hardware </td><td></td><td></td><td> (Thor tilbyr tilsvarende optikk og hardware) </td></tr><tr><td> Suprema Optical Mount, 1.0-i diameter </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter post, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter innlegg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Akromatisk Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave utviklingshemning, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotasjon Stage 1 &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter post, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter innlegg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarizer Rotasjon Mount </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;spacer for 1&quot; diameter innlegg </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;høyde, 1&quot; diameter innlegg </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fork, 1 &quot;diameter innlegg </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Beam Dump </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Microscope objektiv Mount </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter post, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter innlegg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG Laser Mirror, 25,4 mm diameter, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Suprema Optical Mount, 1,0 tommers diameter, rydding festehullet </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> High Precision Knob justeringsskruen, 12.7mm reise, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Tråd adapter, ¼ -20 mannlig, 8-32 kvinner </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod Clamp for 1,5 tommer diameter stang </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 tommer (35,5 cm) høy </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Rail carrier for X26, firkantet 40mm lengde </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Steel Rail, 384mm (15 &quot;) lengde </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rod Plattform for 1,5 tommer diameter stang </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 tommer (35,5 cm) høy </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Konkav linse, 12,7 mm diameter,-25mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-konveks linse, 25,4 mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-konveks linse, 25,4 mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fast Lens Mount, 0,5 &quot;diameter, 1,0&quot; Axis høyde </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Fast Lens Mount, 1,0 &quot;diameter, 1,0&quot; Axis høyde </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mikrosfærer 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO saker </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser axotomy etterfulgt av time-lapse mikroskopi er en følsom analyse for axon regenerering fenotyper i C. elegans 1. Det største hinderet for denne analysen er den oppfattes koster ($ 25-100K) og teknisk kompetanse som kreves for å gjennomføre en laser ablasjon system 2,3. Kan imidlertid solid-state puls lasere av beskjedne kostnader (&lt;$ 10K) gir robust ytelse for laser ablasjon i gjennomsiktig forberedelsene hvor target axons er &quot;close&quot; til vevsoverflaten. Konstruksjon og innretting av et system kan gjennomføres på en dag. Den optiske stien leveres av lys fra den fokuserte kondensatoren til ablasjon laser gir en praktisk innretting guide. En mellomliggende modul med all optikk fjernet kan være dedikert til ablasjon laser og forsikrer at ingen optiske elementer må flyttes i løpet av en laser ablasjon økt. En dichroic i den mellomliggende modulen tillater samtidig bildebehandling og laser ablasjon. Sentrering laserstrålen to den utgående strålen fra den fokuserte mikroskop kondensator objektiv guider den første justeringen av systemet. Et utvalg av linser brukes til stand og utvide laserstrålen til å fylle baksiden blenderåpning på valgt objektiv. Endelig justering og testing er utført med en front overflate speilglass skyve målet. Laser strømmen er justert for å gi en minimum størrelse ablasjon spot (&lt;1um). Den ablasjon spot er sentrert med finjusteringer av de siste kinematically montert speil til trådkorset fast i bildebehandling vinduet. Laser strøm til axotomy vil være ca 10X høyere enn nødvendig for den minste ablasjon flekk på målet lysbildet (dette kan variere med målet du bruker). Ormer kan være immobilized for laser axotomy og time-lapse bildebehandling ved montering på agarose pads (eller i microfluidic kamre 4). Agarose putene er lett gjort med 10% agarose i balansert saltvann smeltes i en mikrobølgeovn. En dråpe av smeltet agarose er plassert på et glass slide og flatet med en annenglass gli inn i en pute rundt 200 um tykk (et enkelt lag av tid tape på tilstøtende lysbilder brukes som en spacer). En &quot;Sharpie&quot; cap brukes til å kutte ut en uniformert diameter rund pute av 13mm. Bedøvelse (1ul Muscimol 20mm) og Mikrokuler (Chris Fang-Yen personlig meddelelse) (1ul 2,65% Polystyrene 0,1 um i vann) er lagt til midten av puten etterfulgt av 3-5 ormer orientert slik at de blir liggende på sin venstre side. Et glass dekkglass er brukt, og deretter vaselin brukes til å forsegle dekkglass og hindre fordamping av prøven.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy etterfulgt av time-lapse imaging er en følsom måte å analysen effekten av mutasjoner i<em&gt; C. elegans</em&gt; On axon gjenfødelse. En høy kvalitet, men billig, kan laser ablasjon system være lett lagt til de fleste mikroskoper. Tid lapse avbildning over 15 timer krever nøye immobilisering av ormen.

Bygging av en lav-budsjett Laser Axotomy System til Study Axon Regeneration i C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system for å studere Mechanotransduction i Fetal lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Enkle Microfluidic enheter for<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Og Sebrafisk

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Kvantitativ Locomotion Study of frittsvømmende Micro-organismer ved hjelp av laser diffraksjon

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Måling av spenningen slipper Under Laser Induced Axon Lesion å evaluere aksonal feste til overflaten på Piconewton og Millisekund Oppløsning

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingeniør 3D Cellularized Kollagen Geleer til Vaskulær Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System for å etterforske Chemotaxis i en 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produksjon av metall nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et verktøy for å studere de antibakterielle egenskapene til nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensjonale vev utvikling justert astrocytter nettverk å Recapitulate utviklingsmessige mekanismer og tilrettelegge nervesystemet gjenfødelse

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...