Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным научным фондом, Макнайт дарственного фонда для проведения Neuroscience, Кристофера и Даны Рив фонда и Amerisure благотворительный фонд.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Есть несколько хороших обсуждений лазерной микрохирургии с различными системами лазерной 3,5-11. Фемтосекундных лазеров ИК-диапазона являются «золотым стандартом» для субклеточных лазерной абляции 12 и удобно, если связанные с изображения объекта, но они часто слишком дорого для отдельных пользователей. Если вам требуется фемтосекундного лазерного ИК-изображений для вашего образца из-за глубины изображения, то вы, вероятно, понадобится один для лазерных axotomy. Прозрачные ткани с целевыми аксоны в пределах 30-50 мкм от поверхности, вероятно, возможно с синими и зелеными импульсные лазеры в 20 мкДж / имп диапазон целевых через объектив высокого погружения па. Там будет больше побочного ущерба с нано-и пико второго лазеров по сравнению с фемтосекундного лазера, тем более что глубина увеличивается целевой аксона. C. Элеганс прозрачна и все аксоны в пределах 20-30 мкм от поверхности. Мы регулярно вырезать двигателя аксонов, которые находятся в пределах 5 мкм от поверхности. Мы также легко режется топоромдополнений среди нервное кольцо, что около 20 мкм от поверхности кутикулы. Мы обнаружили, предел для резки аксонов составляет около 30-50 мкм по диаметру взрослого червя. Вполне вероятно, что система лазерной абляции, описанные здесь будет хорошо работать с большим количеством различных препаратов, которые соответствуют критериям прозрачности и глубины целевой аксонов. Тем не менее, это немного удивительно, учитывая теоретические преимущества фемтосекундных лазеров ИК-порт, что нано-и пикосекундных 355 нм и 532 нм лазеров приносить такой же доход для лазерных axotomy на языке C. Элеганс 6,13. Мы не видим никаких различий в регенерации аксонов в ответ на лазерное axotomy с наносекундным 440 нм, 532 нм наносекундной и фемтосекундной ИК лазеров. Твердотельные лазеры 355 нм УФ примерно ту же стоимость, как 532 нм с диодной накачкой пассивной модуляцией добротности твердотельный лазер, но требуют либо высших сил или оптика, которая эффективно передать эти коротких длин волн. Большинство оптики предназначены для выполнения хорошо видимый 400 -700 нм свет. 355 нм лазеров бы предложить некоторые преимущества 6 таких, как снижение порога плазмы, меньше размер пятна, и длинный проход дихроичных бы эффективнее прямого 100% от лазерной абляции до цели и позволяют одновременно изображений GFP без потери образец сигнала. Синие лазеры 440 нм сохранит преимущества работы с видимым лазерным светом (хорошая производительность со стандартной оптикой и безопасности). К сожалению, стоимость DPP добротности твердотельных 440 нм лазер в 3 раза стоимость 355nm или 532 нм лазер аналогичной мощности в это время. Если мы разрабатывали новую систему для C. Элеганс, где целевая глубина минимальна, мы хотели бы выбрать для УФ-прозрачного хрусталика (стоимость около $ 3000 за 40X 1.3na линзы нефти с 50-70% пропускания при 355nm) и 355 нм лазер производит 5-10 мкДж / имп на 1 -20 кГц. Axon абляции, как считается, из-за плазменного образования. Более короткие импульсы будут производить плазменные пороговых значений, при меньшей мощности и объемы плазмы W<html> плохо быть меньше 6. Целью является производство маленьких и кратчайшим сроком плазмы путем изменения энергии импульса до самой низкой мощности. Большие долгоживущих плазме будут генерировать кавитационных пузырьков, которые повреждают окружающие клетки. В целом, мы обнаружили, что удаление используя около 50-100 импульсов на высокой частоте (т.е. 2,5 кГц) дает наилучшие результаты. Это говорит о том, что ущерб может быть постепенно интегрирована в течение серии импульсов, чтобы лучше контролировать размер ущерба. Система лазерной абляции, описанный здесь, очень снисходительно, если луч выравнивается и расширена точно. Мы начинаем резки аксонов у взрослых червей на 10% мощности лазера (в среднем 0,3 мВт измеряется при 2500 Гц и около 1 мкДж / имп) и могут сократить с ограниченными локализованное повреждение до 14% мощности. Вы можете наблюдать большие площади ущерба от 15-39 мощности лазерного%, но только выше 40% мощности (около 1 мВт среднем измеряется при 2500 Гц) делают черви взорваться из-за больших кавитационных пузырьков и повреждения кутикулы червя. e_content &quot;&gt; Штайнмайером и соавт. 2010 2 бумага является отличным ресурсом для построения системы лазерной абляции. Леон Avery также имеет хорошие практические описание системы лазерной абляции на основе недорогого газа N2 337 нм лазер, и он предоставляет некоторые большое практическое советы (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). При разработке собственной системы, которую вы должны сначала поговорить с вашим микроскопом представитель чтобы определить, как целевой лазерной абляции для объектива микроскопа. Ваш микроскоп должен быть установлен на столе виброизоляции (Ньюпорт, TMI, Тор). макет верхней является оптимальным, но твердой стали топ-прежнему можно использовать с магнитной позиционеров. посвященная промежуточным модуля на вертикальном сферу приятно, потому что все оптические элементы могут быть оставлены на месте. Тем не менее, может быть дешевле и удобнее в использовании камеры порта (перевернутой) или &quot;комбайнер&quot;, прикрепленные к эпи-флуоресцентный порт. Вы должны знать размер диафрагмы и обратно пропускания (по крайней<html> blation длины волны лазерного излучения) объектива вы собираетесь использовать. Как только вы решите на лазерном (например, Crylas, кишат, Кристалл, или CRC), вы должны связаться с Тором или Ньюпорт за помощь в выборе правильного оптических элементов, оборудования и оборудования для обеспечения безопасности. Мы остановились на двойной Галилея расширителем пучка, чтобы сэкономить место, но более простой кеплеровской расширитель вариант (f2/f1 = коэффициент расширения). Пользовательские расширителем пучка будет самый дешевый, но Ньюпорт, Тор, и несколько лазерных производители предлагают отличное качество коммерческих луч расширителей. Некоторые лазерные производители также предлагают ручной и электронным управлением аттенюаторов, которые могут быть экономически эффективными и экономия места, но не столь универсальны, как Глана-Томпсона поляризатор и пластину полуволны. Вы также должны решить, как управлять лазером. Вы можете спроектировать LabView контроллер, использование коммерческих генератор TTL, или программное обеспечение, лазерный компании. Обсудить варианты с конкретным производителем лазера. палатка &quot;&gt; Мы предоставили список аппаратных мы использовали только в качестве общего руководства. системы, описываемой здесь стоит около $ 15000 при добавлении к нашей существующей системе формирования изображения. Ваш местный отдел физики часто будет кто-то готов предоставить практическое введение в безопасной работы с лазеров на свободных луча. Альтернативные методы иммобилизации и промежуток времени визуализации C. Элеганс недавно были описаны 14. Поиск неисправностей Наиболее трудным и важным этапом является выравнивание центру расширить луча оптической оси микроскопа. После того как вы луч по центру и расширены за счет Галилея линз вы должны упорно трудиться, чтобы получить его выровнены с точностью до 5 мкм оптической оси микроскопа Перед использованием рулевого зеркала для окончательного выравнивания по центру. Чрезмерное использование рулевого зеркал для выравнивания луч микроскопа будет двигать его от оси, проходящей через лучрасширителя. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНО ОСТОРОЖНЫ вы можете ослабления лазерного пучка с соответствующим фильтром ND и непосредственно просмотреть профиль лазерного луча на отражающую цели (перед зеркальной поверхности). Вы можете мягко подтолкнуть микроскопом, чтобы точно центре пучка в 60X поле зрения цель (если она не может быть сосредоточена в вверх / вниз, диапазон вам нужно настроить высоту рельс). Профиля пучка может быть использована для точного выравнивания оптической оси микроскопа, чтобы дать в центре пучка, круговые и &quot;вспышки&quot; симметрично. Асимметричной вспышке признак того, что микроскоп ось не идеально ровные (или железнодорожным не уровень). Наконец, вы должны настроить L3 и посмотреть, даже и симметричном расширении и сжатии луча. Фокус микроскопом именно на поверхности мишени, а затем настроить L3 сфокусировать лазерный луч до мельчайших месте. Теперь вы должны найти, что лазерный луч находится в пределах 5 мкм от центра, когда отображаемого через LSCM или ПЗС-система и абляции пятно находится в пределах1 мкм фокус Z. Если вы обнаружили, что &quot;взрыв&quot; червей или последовательно генерации больших кавитационных пузырьков, чтобы сократить аксонов ваша проблема, скорее всего, штраф выравнивание лазерной абляции. Убедитесь, что минимальный (&lt;500 нм) абляции пятно локализовано в фокусе Z (регулировать сближение с L3 объектива) и XY фидуциарных пятно (настройки с прошлым кинематически смонтированы зеркала). Ориентация аксонов ближе к поверхности будет требоваться меньше мощности лазера. Аналогичным образом, мелких животных (L1 и L2) будет требоваться меньше мощности лазера для axotomy по сравнению с той же ориентации аксонов у взрослых. Если ваш дикий тип аксонов не восстанавливаются или отбеливателя аксонов вы должны попробуйте уменьшить изображение мощность лазера или уменьшении частоты дискретизации. Если черви умирают или становятся болезненным попробуйте уменьшить процент агарозы с шагом 1%. Убедитесь, что вы не движется покровное после монтажа червей, как это часто заставляет их умирать при использовании высоких вcentage агарозы и микросфер. Если черви взорваться или умирают во время замедленной сессии это связано с: 1. Процент агарозном слишком высока. 2. Повреждение кутикулы путем лазерной абляции. 3. Движение покровное после монтажа. Если повреждения кутикулы виноват он будет влиять только на установленный червей, которые стали мишенью с лазерной абляции. Если червь движется слишком много во время замедленной сессии попробуйте увеличить процент агарозы в 0,5% шаги. Здоровый аксонов у здоровых червей всегда &quot;активный&quot; и отображения постоянный уровень флуоресценции. Если вы увидите резкое уменьшение флуоресценции или деятельности червь умирает или мертвым. Несколько бисером или фрагментарной аксоны верный признак умирающего или умершего червя. Если у вас есть проблемы с поддержанием вашего аксонов в центре внимания в течение всего сеанса промежуток времени может быть несколько различных задач. Первый этап проверить дрейф изображений инертного образца на предметное стекло в течение 10 чRS. Несколько микрон дрейфа может быть связано с тепловой неустойчивости, но больше 5 мкм, вероятно, из-за механических проблем с вашим микроскопом. Проблемы с монтажными являются более распространенными. Пусть ваш смонтированный червей равновесие со своим столике микроскопа в течение 30 минут перед началом промежуток времени. Убедитесь, что вазелин печать не развивались утечек в ходе сеанса промежуток времени.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер по каталогу </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> 535 нм лазерный </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (Кишат, Кристалл, и КПР также предлагают сопоставимую лазеры) </td></tr><tr><td> Все оптические и аппаратного обеспечения </td><td></td><td></td><td> (Thor предлагает сопоставимых оптики и оборудования) </td></tr><tr><td> Suprema Оптический горе, 1,0-в диаметре </td><td> Ньюпорт </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;диаметром сообщению, 1&quot; высота </td><td> Ньюпорт </td><td> ПС-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;диаметром сообщение вилкой </td><td> Ньюпорт </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ахроматический нулевого Вавель Plate, ½ волны отсталость, 400-700нм </td><td> Ньюпорт </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Вращение этап, 1 &quot;Aperature </td><td> Ньюпорт </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;диаметром сообщению, 1&quot; высота </td><td> Ньюпорт </td><td> ПС-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;диаметром сообщение вилкой </td><td> Ньюпорт </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Глан-Laser Кальцит поляризатор, 430-700нм </td><td> Ньюпорт </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Поляризатор вращения горе </td><td> Ньюпорт </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;прокладку для 1&quot; диаметром сообщение </td><td> Ньюпорт </td><td> PS-0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;высота, 1&quot; диаметром сообщение </td><td> Ньюпорт </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Вилка, 1 &quot;диаметром сообщение </td><td> Ньюпорт </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Луч Дамп </td><td> Ньюпорт </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Микроскоп Цель Крепление объектива </td><td> Ньюпорт </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;диаметром сообщению, 1&quot; высота </td><td> Ньюпорт </td><td> ПС-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;диаметром сообщение вилкой </td><td> Ньюпорт </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Высоких энергий Nd: YAG лазер Mirror, 25,4 мм диаметр, 45 °, 532 нм </td><td> Ньюпорт </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Suprema Оптический горе, диаметром 1,0 дюйма, разрешение монтажное отверстие </td><td> Ньюпорт </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Высокоточный Ручка регулировки Винт, 12,7 путешествия, 100TPI </td><td> Ньюпорт </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Резьбовой переходник, ¼ -20 мужчины, женщины 8-32 </td><td> Ньюпорт </td><td> СС-1-Б </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Род Зажим для 1,5-дюймовый диаметр штока </td><td> Ньюпорт </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Род, 14 дюймов (35,5 см) в высоту </td><td> Ньюпорт </td><td> 40 </TD&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Железнодорожный перевозчик для X26, квадрат 40 мм длины </td><td> Ньюпорт </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Сталь железнодорожных, 384mm (15 &quot;) длиной </td><td> Ньюпорт </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Род Платформы 1,5 дюйма диаметр штока </td><td> Ньюпорт </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Род, 14 дюймов (35,5 см) в высоту </td><td> Ньюпорт </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Плоско-вогнутая линза, 12,7 мм диаметр, 25 мм-EFL, 430-700нм </td><td> Ньюпорт </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Плоско-выпуклой линзы, диаметр 25,4 мм, 50.2mm EFL, 430-700нм </td><td> Ньюпорт </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Плоско-выпуклой линзы, диаметр 25,4 мм, 62.9mm EFL, 430-700нм </td><td> Ньюпорт </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Фиксированные Крепление объектива, 0,5 &quot;диаметром 1,0&quot; оси высоты </td><td> Ньюпорт </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Фиксированные Крепление объектива, 1.0 &quot;диаметром 1,0&quot; оси высоты </td><td> Ньюпорт </td><td> ЛГ-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Микросферы 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Агароза </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> РВЗ вопросам </td></tr><tr><td> Мусцимол </td><td> Сигма </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Лазерная axotomy следуют покадровой микроскопии является чувствительным тест для фенотипов аксон регенерации в C. Элеганс 1. Основная трудность данного анализа воспринимается стоимость ($ 25-100K) и технические знания, необходимые для реализации системы лазерной абляции 2,3. Тем не менее, твердотельные лазеры скромных затрат (&lt;$ 10K), могут обеспечить надежную производительность для лазерной абляции в прозрачной подготовки, где целевые аксоны &quot;близка&quot; к поверхности ткани. Строительство и выравнивание системы может быть выполнена в день. Оптического пути при условии, светом сосредоточено конденсатора к лазерной абляции обеспечивает удобное руководство выравнивания. Промежуточный модуль с оптикой удалены все может быть посвящен лазерной абляции и уверяет, что ни оптические элементы должны быть перемещены во время сеанса лазерной абляции. Дихроичных в промежуточном модуль позволяет одновременно с изображениями и лазерной абляции. Центрирование лазерного луча то исходящего пучка от сфокусированного линзой микроскопа конденсатора руководств начального выравнивания системы. Различные линзы используются для состояния и расширить лазерный луч, чтобы заполнить назад отверстие выбранной линзы объектива. Заключительные согласования и тестирования осуществляется с передней поверхности зеркальный целевой предметное стекло. Мощность лазера корректируется, чтобы дать минимальные месте абляции размера (&lt;1 мкм). Абляции пятно в центре с точной настройки последнего кинематически установлены зеркала, чтобы перекрестие зафиксирован в изображение окна. Мощность лазера для axotomy будет примерно в 10 раз выше, чем необходима для минимального месте абляции на целевой слайд (это может меняться в зависимости от целевого использования). Черви могут быть иммобилизованы для лазерных axotomy и покадровой визуализации за счет установки на площадках агарозы (или в микрофлюидных камерах 4). Агарозном колодки легко сделать с 10% агарозном в сбалансированном солевом плавится в микроволновой печи. Капли расплавленного агарозы помещают на предметное стекло и уплощенная с другимстекло на площадку около 200 мкм (один слой ленты времени на смежных слайдов используется в качестве спейсера). &quot;Шулера&quot; крышка используется для вырезать форме диаметр круговой площадке 13 мм. Анестетики (1UL мусцимол 20 мм) и микросфер (Chris Фан-Йен личное общение) (1UL 2,65% полистирола 0,1 мкм в воде) будут добавлены в центре площадки следуют 3-5 червей ориентированы так, они лежат по левую стороны. Покровное стекло наносят вазелин, а затем используется для герметизации покровное и предотвратить испарение образца.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Лазерная axotomy следуют покадровой визуализации чувствительных способов анализа эффектов мутаций в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; По регенерации аксона. Высокое качество, но недорогой, лазерная абляция система может быть легко добавлены к большинству микроскопов. Временной интервал изображения более 15 часов требует тщательного иммобилизации червя.

Построение и недорогие лазерные Axotomy система по изучению Axon Регенерация в С. Элеганс</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Экспериментальная система по изучению механотрансдукции в эмбриональные клетки легких

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Простой микрофлюидных устройства для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация<em&gt; C. Элеганс</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; И данио рерио

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Количественные исследования локомоции свободно плавающих микроорганизмов с помощью лазерной дифракции

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Инженерные 3D Cellularized Коллаген Гели для сосудистой регенерации ткани

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar градиентной диффузионной системы по расследованию хемотаксис в 3D коллагеновой матрице

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Получение металлических наночастиц импульсной лазерной абляцией в жидкостях: инструмент для изучения антибактериальных свойств наночастиц

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...