Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Denna forskning stöds av National Science Foundation, McKnight Endowment Fund for Neuroscience, den Christopher och Dana Reeve Foundation och Amerisure Charitable Foundation.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Det finns flera bra diskussioner med laser mikrokirurgi med olika lasersystem 3,5-11. Femtosekund IR-lasrar är den &quot;gyllene standarden&quot; för subcellulära laser ablation 12 och bekvämt om i samband med en avbildning anläggning, men de är ofta för dyrt för enskilda användare. Om du behöver en femtosecond IR-laser för avbildning ditt prov på grund av djupet i bildhantering då du kommer förmodligen behöva en för laser axotomy. Transparent vävnader med målet axoner inom 30-50 um av ytan är nog genomförbart med blå och gröna puls lasrar i 20 UJ / puls rad riktade genom en hög na nedsänkning lins. Det kommer att bli mer följdskador med nano och pico second lasrar jämfört med femtosecond laser, särskilt som djup ökar målet axonet. C. elegans är transparent och alla axoner är inom 20-30 um av ytan. Vi skär rutinmässigt motoriska axoner som ligger inom 5 um av ytan. Vi har också lätt att skära yxaons inom nerv ring som är ca 20 um från nagelbanden ytan. Vi fann gränsen för kapning axoner till ca 30-50 um genom diametern på en vuxen mask. Det är troligt att lasern ablation som beskrivs här skulle fungera bra med många olika preparat som passar kriterierna öppenhet och djup mål axoner. Ändå är det lite förvånande med tanke på de teoretiska fördelarna med femtosecond IR-laser, som nano-och pikosekund 355 nm och 532 nm lasrar utföra så bra för laser axotomy i C. elegans 6,13. Vi ser inga skillnader i axonet förnyelse som svar på laser axotomy med nanosekund 440 nm, nanosekund 532 nm och femtosecond IR-lasrar. Solid state 355 nm UV-lasrar är ungefär samma kostnad som 532 nm diod pumpas passivt Q-switchade solid state laser, men kräver antingen högre makter eller optik som effektivt passerar dessa kortare våglängder. De flesta optik är utformade för att fungera bra med synliga 400 -700 nm ljus. 355 nm lasrar skulle ge några fördelar 6 exempel minskad plasma tröskeln, mindre plats storlek, och en lång passning dikroisk skulle effektivt direkt 100% av ablation laser för att målet och tillåter samtidig avbildning av GFP utan förlust av prov signal. Blå 440 nm lasrar skulle behålla fördelarna med att arbeta med ett synligt ljus laser (bra prestanda med standard optik och säkerhet). Tyvärr är kostnaden för en DPP Q-switchade solid state 440 nm laser 3 gånger kostnaden för en 355nm eller 532 nm laser liknande effekt vid denna tid. Om vi skulle utforma ett nytt system för C. elegans, där målet djup är minimal, skulle vi välja en UV-transparent lins (kosta ungefär $ 3,000 för en 40X 1.3na olja objektiv med 50-70% transmittans vid 355nm) och en 355 nm laser som producerar 5-10 UJ / puls vid 1 -20 kHz. Axon ablation tros bero på plasma bildas. Kortare pulser kommer att producera plasma gränsvärden på en lägre effekt och vilka volymer plasma w<html> sjuk vara mindre 6. Målet är att producera den minsta och kortaste livslängd plasma genom att justera pulsenergi till den lägsta makten. Större långlivade plasmor kommer att generera kavitation bubblor som skadar omgivande celler. Vi har generellt funnit att ablation med ca 5-10 pulser på högsta frekvens (dvs 2.5kHz) ger bäst resultat. Detta tyder på att skador kan gradvis integreras över en serie av pulser för att bättre kontrollera omfattningen av skadorna. Lasern ablation som beskrivs här är mycket förlåtande om strålen är anpassad och utökad korrekt. Vi börjar skära axoner till vuxna maskar på 10% lasereffekt (genomsnitt 0,3 mW mäts vid 2500 Hz och uppskattningsvis 1 UJ / puls) och kan skära med begränsade lokala skador med 14% effekt. Du kan observera större områden av skador från 15 till 39% laser effekt, men endast över 40% effekt (ca 1 mW genomsnitt mätt vid 2500 Hz) inte maskarna explodera på grund av stora kavitation bubblor och skador på maskens nagelbanden. e_content &quot;&gt; Den Steinmeyer et al. 2010 2 papper är en utmärkt resurs för att bygga ett system laser ablation. Leon Avery har även en fin praktisk beskrivning av en laser ablation system baserat på en billig N2 gas 337 nm laser och han ger några stora praktiska råd (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). När du utformar ditt eget system bör du först tala med din mikroskop representant för att avgöra hur man ska rikta ablation laser för mikroskop målet. Din mikroskop skall monteras på en vibrationsisolering bord (Newport, TMI, Thor). En bakbord toppen är optimal, men en massiv stål topp kan fortfarande användas med magnetiska lägesställare. En dedikerad mellanliggande modul på en upprätt omfattning är trevligt eftersom alla optiska element kan lämnas kvar på plats. Men det kan vara billigare och bekvämare att använda en kamera port (inverterad) eller en &quot;combiner&quot; som bifogas ett epi-fluorescerande port. Du behöver veta storleken på ryggen bländare och transmittans (på en<html> blation laser våglängd) av objektiv du tänker använda. När du bestämmer dig för en laser (t.ex. Crylas, ÖSREGNA, Crystal, eller barnkonventionen) bör du kontakta Thor eller Newport för hjälp med att välja rätt optiska element, hårdvara och säkerhetsutrustning. Vi bestämde oss för en dubbel galileiska strålar Expander för att spara utrymme, men en enklare Keplerian Expander är ett alternativ (f2/f1 = expansionsfaktor). En anpassad balk expander kommer att vara den billigaste, men Newport, Thor, och flera av laser tillverkare erbjuder utmärkt kvalitet kommersiella balk expandrar. Vissa laser tillverkare erbjuder också manuella och elektroniskt styrda dämpare som kan vara kostnadseffektiv och utrymmessnål, men inte lika mångsidig som den Glan-Thompson polarisator och halv våg plattan. Du måste också bestämma hur man styr lasern. Du kan designa en LabView baserat styrsystem, använda ett kommersiellt TTL-generator, eller programvara som tillhandahålls av lasern företaget. Diskutera alternativen med den specifika laser tillverkaren. tält &quot;&gt; Vi har lämnat en förteckning över den hårdvara vi använt endast som en allmän vägledning. Systemet beskrivs här kostar ca $ 15.000 när de läggs till våra befintliga Imaging System. Din lokala fysik avdelning kommer ofta någon som är villig att ge en praktisk introduktion till tryggt att arbeta med fri stråle laser. Alternativa metoder för fixering och time lapse avbildning av C. elegans har nyligen beskrivits. 14 Felsökning Den svåraste och kritiska steget är anpassning av den utvidgade centrerad balk till den optiska axeln i mikroskop. När du har strålen centrerad och expanderat genom Galiléen linser du ska arbeta hårt för att få det anpassat till inom 5 um av mikroskopet optiska axel Innan du använder Speglar som kan styra för den slutliga anpassningen till centrum. Överdriven användning av styrningen speglar för att justera strålen till mikroskop kommer att flytta bort axel genom strålenExpander. ANVÄNDA EXTREME VARNING du kan dämpa laserstrålen med lämpliga ND-filter och direkt visa profilen laserstrålen på ett reflekterande mål (framsidan spegel). Du kan lätt knuffa mikroskop för att exakt centrera balk i 60X objektiv synfältet (om det inte kan vara centrerad i upp / ned intervall du behöver justera rälsen höjd). Strålen profilen kan användas för att exakt justera mikroskopet optiska axeln för att ge en centrerad balk som är rund och &quot;bloss&quot; symmetriskt. En asymmetrisk flare är en indikation på att mikroskopet axeln inte är helt är i linje (eller tåg är inte nivå). Slutligen bör du justera L3 och se en jämn och symmetrisk expansion och kontraktion av strålen. Fokusera mikroskop exakt på målet ytan och sedan justera L3 att fokusera laserstrålen till den minsta fläck. Du bör nu hitta att laserstrålen är inom 5 um i mitten när avbildas via LSCM eller CCD-systemet och ablation platsen ligger inom1um av Z fokus. Om du upptäcker att du är &quot;blåser upp&quot; maskar eller konsekvent generera stora kavitation bubblor för att klippa axoner ditt problem är förmodligen den fina anpassningen av ablation laser. Se till att den minsta (&lt;500nm) ablation plats är lokaliserad till Z fokus (justera konvergensen med L3-objektiv) och XY-förvaltare plats (justera med förra kinematically monterad spegel). Inriktning axoner närmare ytan kräver mindre lasereffekt. På samma sätt kommer mindre djur (L1 och L2) kräver mindre lasereffekt för axotomy jämfört med inriktning på samma axoner till vuxna. Om din vildtyp axoner inte regenerera eller axoner blekmedel bör du försöka minska avbildning lasereffekt eller minska samplingsfrekvensen. Om dina maskar dör eller blir sjuka försök att minska procent agaros i steg om 1%. Kontrollera att du inte flyttar täckglas efter monteringen maskar eftersom detta kommer ofta få dem att dö när du använder höga percentage agarosen och mikrosfärer. Om dina maskar spricka eller dör under ett tidsförlopp sessionen Det beror på: 1. Andel agarosen är för hög. 2. Skador på nagelbanden med ablation laser. 3. Förflyttning av täckglas efter montering. Om skador på nagelbanden är fel det påverkar endast monteras maskar som har riktat med ablation laser. Om din mask rör sig för mycket under en time-lapse session försöka öka andelen agaros i 0,5% steg. Friska axoner friska maskar är alltid &quot;aktiva&quot; och visar en jämn fluorescens. Om du ser en plötslig minskning av fluorescens eller aktivitet masken är döende eller döda. Flera pärlstav eller fragmenterade axoner är ett säkert tecken på en döende eller döda mask. Om du har problem att hålla din axoner i fokus under hela tiden förfaller sessionen det kan finnas flera olika problem. Kontrollera först din scen glida genom avbildning ett inert prov på en glasplatta under 10 hRS. Några mikrometer drift kan bero på termisk instabilitet, men större än 5 um är förmodligen på grund av mekaniska problem med din mikroskop. Problem med montering är vanligare. Låt din monteras maskar jämvikt med mikroskop scenen i 30 minuter innan din tid förfaller. Kontrollera att din vaselin tätningen inte läcka under din tid förfaller session.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (tillval) </th></tr><tr><td> 535 nm Laser </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (ÖSREGNA, Crystal, och CRC erbjuder också jämförbara laserskrivare) </td></tr><tr><td> Alla optik och hårdvara </td><td></td><td></td><td> (Thor erbjuder jämförbara optik och hårdvara) </td></tr><tr><td> Suprema Optisk Mount, 1,0-i diameter </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter inlägg, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter inlägg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Akromatisk Zero-Order Wavel tavla, ½ Wave retardation, 400-700 nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotation Stage, 1 &quot;Aperature </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter inlägg, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter inlägg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Laser Calcite Polariserande, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarisator Rotation Mount </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ¼ &quot;spacer för 1&quot; diameter inlägg </td><td> Newport </td><td> PS-0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;höjd, 1&quot; diameter inlägg </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Gaffel, 1 &quot;diameter inlägg </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Beam Dump </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Mikroskop Mål Objektivfattning </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter inlägg, 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;diameter inlägg gaffel </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> High-Energy Nd: YAG-laser Spegel, 25,4 mm diameter, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Suprema Optisk Mount, 1,0 tums diameter, clearance monteringshål </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> High Precision Ratt justerskruv, 12.7mm resor, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Gängadapter, ¼ -20 hane, 8-32 kvinnliga </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Monteringsfäste för 1,5 tums diameter stång </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 tum (35,5 cm) lång </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Rail bärare för X26, fyrkantiga 40 mm längd </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Stål Rail, 384mm (15 &quot;) längd </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rod Plattform för 1,5 tums diameter stång </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Rod, 14 tum (35,5 cm) lång </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> PLANKONKAV lins, 12,7 mm diameter,-25mm EFL, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-konvex lins, 25,4 mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-konvex lins, 25,4 mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700 nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Fast Objektivfattning, 0,5 &quot;diameter, 1,0&quot; Axis höjd </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Fast Objektivfattning, 1,0 &quot;diameter, 1,0&quot; Axis höjd </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mikrosfärer 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00.876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosen </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO frågor </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Laser axotomy följt av tidsförlopp mikroskopi är en känslig analys för axonet förnyelse fenotyper i C. elegans 1. Den största svårigheten med denna analys är den upplevda kostnaden ($ 25-100K) och teknisk expertis som krävs för genomförande av ett system laser ablation 2,3. Däremot kan solid-state puls lasrar anspråkslösa kostnader (&lt;$ 10K) ger robusta prestanda för laser ablation i transparent preparat för vilka mål axoner är &quot;nära&quot; till vävnaden ytan. Konstruktion och anpassning av ett system kan göras på en dag. Den optiska väglängden som ljuset från fokuserade kondensorn till ablation laser ger en bekväm justeringsledaren. En mellanliggande modul med alla borttagna optik kan ägnas åt ablation laser och försäkrar att inga optiska element behöver flyttas under en laser ablation session. En dikroiskt i mellanliggande modulen tillåter samtidig avbildning och laser ablation. Centrering laserstrålen to den utgående strålen från den fokuserade mikroskopet kondensor lins vägleder den inledande anpassning av systemet. En mängd olika linser används för att kondition och expandera laserstrålen för att fylla upp bländaren på utvalda objektiv. Slutlig anpassning och testning sker med en främre yta spegelglas skjuter mål. Laser strömmen justeras för att ge en minsta strålpunkt ablation (&lt;1um). Ablation platsen är centrerad med finjusteringar av de sista kinematically monteras spegel för hårkors fastställs i bildbehandling fönster. Laser kraft för axotomy kommer att vara cirka 10 gånger högre än nödvändigt för minsta ablation plats på målet bilden (detta kan variera med det mål du använder). Maskar kan vara orörlig under laser axotomy och Time-lapse avbildning av montering på agaros kuddar (eller i mikroflödessystem kammare 4). Agarosen kuddar görs enkelt med 10% agaros i balanserad saltlösning smält i mikrovågsugn. En droppe av smält agaros är placerad på en glasplatta och tillplattat med en annanglasskiva i en rondell ca 200 um tjock (ett enda lager av tid tejp på angränsande bilder används som en spacer). En &quot;Sharpie&quot; cap används för att skära ut en uniformerad diameter rund pad av 13mm. Bedövning (1ul Muscimol 20mm) och Mikrosfärer (Chris Fang-Yen personlig kommunikation) (1ul 2,65% Polystyren 0,1 um i vatten) läggs till i mitten av plattan följt av 3-5 maskar orienterade så att de ligger på sin vänstra sida. Ett glas täckglas tillämpas och sedan vaselin används för att täta täckglas och förhindra avdunstning av provet.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy följt av tidsförlopp imaging är ett känsligt sätt att analysera effekter av mutationer i<em&gt; C. elegans</em&gt; På Axon föryngring. En hög kvalitet, men billiga, kan laser ablation systemet enkelt läggas till de flesta mikroskop. Time lapse avbildning mer än 15 timmar kräver noggrann fixering av masken.

Konstruera en låg budget Laser Axotomy systemet studerar Axon Regeneration i C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Ett experimentellt system för att studera Mechanotransduction i fetal lunga Celler

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Enkla mikroflödessystem enheter för<em&gt; In vivo</em&gt; Avbildning av<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Och zebrafisk

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Kvantitativ Locomotion Studie av fritt Simning Mikroorganismer Använda laserdiffraktion

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Mätning av spänning Release Under Laser Induced Axon skada som Utvärdera Axonal vidhäftning vid Piconewton och millisekundsupplösning

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Ingenjörs 3D Cellularized kollagengeler för kärlvävnad Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Diffusion System för att undersöka Chemotaxis i en 3D kollagenmatris

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produktion av metall nanopartiklar genom pulserad laserablation i vätskor: Ett verktyg för att studera de antibakteriella egenskaperna hos nanopartiklar

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensionella vävnadstekniska justerad Astrocyten nätverk att Recapitulate utvecklingsmässiga mekanismer och underlätta nervsystemet regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...