Name: constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı, Nörobilim McKnight Endowment Fund, Christopher ve Dana Reeve Vakfı ve Amerisure Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branching.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).</li><li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser.">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J. Microsc. 234, 1-8 (2009).</li><li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo.">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).</li><li>Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation.">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).</li><li>Tsai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-mediated+ablation:+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems.">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).</li><li>Shen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+cytoskeletal+filaments+and+mitochondria+in+live+cells+using+a+femtosecond+laser+nanoscissor.">Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor.</a> Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates.">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

3,5-11 farklı lazer sistemleri ile lazer mikrocerrahi çeşitli tartışmalar vardır. Femtosecond kızılötesi lazerler, 12 ve rahat bir görüntüleme tesisi ile ilişkili hücre içi lazer ablasyon için &quot;altın standart&quot;, ama bireysel kullanıcılar için genellikle çok pahalı . Görüntüleme derinliği nedeniyle görüntüleme örnek için femtosecond kızılötesi lazer ihtiyacınız varsa o zaman muhtemelen bir lazer axotomy için ihtiyacınız olacak. Yüzeyinin 30-50 um içinde hedef aksonlar Şeffaf dokular muhtemelen yüksek na daldırma objektifi aracılığıyla hedeflenen 20 UJ / nabız aralığında, mavi ve yeşil darbe lazerler ile mümkün. Özellikle hedef akson derinliği artar olarak, femtosecond lazer ile karşılaştırıldığında nano ve pico ikinci lazerler daha çok hasar var. C. elegans şeffaf ve tüm aksonlar yüzeyinin 20-30 um içinde. Biz rutin yüzeyinin 5 um içinde motor aksonlar kesti. Ayrıca kolayca balta kestikmanikür yüzeyi yaklaşık 20 um sinir halkası içinde ons. Biz yetişkin bir solucan çapı ile yaklaşık 30-50 um aksonlar kesme sınırı bulundu. Burada açıklanan lazer ablasyon sistemi, şeffaflık ve derinliği hedef akson kriterlere uygun birçok farklı hazırlıklarını iyi iş olasıdır. Yine de, bu biraz şaşırtıcı IR femtosecond lazerler, nano ve pikosaniye 355 nm ve 532 nm lazerler teorik avantajları göz önüne alındığında, C. lazer axotomy için çok iyi bir performans elegans 6,13. Biz nanosaniyelik 440 nm, 532 nm nanosaniyelik ve femtosecond kızılötesi lazerler lazer axotomy yanıt akson rejenerasyonu açısından herhangi bir farklılık görüyoruz. Katı hal 355 nm UV lazerler 532 nm pasif Q-anahtarlı katı hal lazer pompalanır aynı maliyet ile ilgili, ancak bu kısa dalga boyuna verimli geçmesi ya da daha yüksek güçler veya optik gerektirir. Çoğu optik görünür 400 ile iyi bir performans için tasarlanmıştır.700 nm ışık. 355 nm lazerler 6 gibi düşük plazma eşik, küçük spot büyüklüğü, ve ablasyon lazer hedef% 100 verimli bir şekilde doğrudan ve örnek sinyal kaybı olmadan GFP eş zamanlı görüntüleme sağlayacak uzun bir pas dikroik gibi bazı avantajları sunacak. Mavi 440 nm lazerler, görünür ışık lazer ile (standart optikler ve güvenliği ile iyi bir performans) çalışma avantajlarını tutacak. Ne yazık ki, bir DPP-Q-anahtarlı katı hal 440 nm lazer maliyet, şu anda benzer bir güç 355nm veya 532 nm lazer 3 kez maliyetidir. C için yeni bir sistem tasarımı olsaydı elegans, hedef derinlik az olduğu, 1 UV şeffaf lens (355nm az% 50-70 geçirgenliği ile maliyet 40X 1.3na petrol lens için yaklaşık 3000 $) ve 355 nm lazer 5-10 UJ / darbe üreten bir tercih olur -20 kHz. Axon ablasyon plazma oluşumu nedeniyle olduğu düşünülmektedir. Kısa bakliyat, düşük güç ve plazma hacimleri w plazma eşikleri üretecek<html> hasta 6 adet daha küçük olabilir. Amaç, darbe enerjisi en düşük güç ayarlayarak küçük ve kısa ömürlü plazma üretmek için. Büyük uzun ömürlü plazmalar kavitasyon baloncukları üretecektir hücreleri çevreleyen zarar verebilir. Biz genelde, yüksek frekans (yani 2.5kHz) 50-100 hakkında bakliyat kullanarak o ablasyon bulduk en iyi sonucu verir. Bu hasar yavaş yavaş bakliyat hasarın boyutunu daha iyi kontrol etmek için bir dizi üzerinden entegre edilebilir göstermektedir. Demeti hizalı ve doğru genişletilmiş ise, burada açıklanan lazer ablasyon sistemi, çok bağışlayıcıdır. Biz,% 10 lazer gücü (ortalama 0.3 mW 2500 Hz&#39;de ölçülür ve tahmini 1 UJ / pulse) yetişkin solucan aksonlar kesme ve% 14 güç ile sınırlı lokalize hasar kesebilir. Hasar daha büyük alanlar% 15-39 lazer güç izleyebilirsiniz, ancak sadece% 40 güç (yaklaşık 1 mW ortalama 2500 Hz&#39;de ölçülen) Yukarıdaki solucanlar büyük kavitasyon baloncukları ve solucan manikür zarar nedeniyle patlayabilir. e_content &quot;&gt; Steinmeyer ve ark. 2010 2 kağıt, lazer ablasyon sistemi oluşturmak için mükemmel bir kaynak. Leon Avery de ucuz bir N2 gaz 337 nm lazer tabanlı bir lazer ablasyon sistemi güzel bir pratik tanımı ve bazı büyük pratik sağlar tavsiye (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /) kendi sistemi tasarlarken ilk mikroskop hedefi nasıl ablasyon lazer hedef belirlemek için mikroskop temsilcisi ile konuşmak gerekir. mikroskop bir titreşim izolasyonu masaya monte edilmelidir (Newport, TMI, Thor). breadboard en optimal düzeyde, ancak sağlam bir çelik üst hala manyetik konumlandırıcılı kullanılabilir tüm optik elemanlar yer bırakılmalıdır çünkü dik bir kapsamda özel bir ara modül güzel Ancak, daha az pahalı ve kamera bağlantı noktası (ters) veya epi-floresan bir bağlantı noktasına bağlı bir &quot;birleştirici&quot; kullanmak daha uygun olabilir (bir arka diyafram ve geçirgenliği boyutunu bilmek gerekir<html> blation lazer dalga boyu) objektif lens kullanmak niyetinde. Bir kez bir lazer (örneğin, Crylas, teem, Kristal, ya da CRC) Thor ya da Newport doğru optik elemanlar seçerek, donanım ve güvenlik donanımları ile ilgili yardım için başvurmalısınız karar verir. Biz yer kazanmak için bir çift Galile ışın genişletici karar verdi, ancak basit bir Kepler genişletici bir seçenek (f2/f1 = genişleme faktörü). Özel bir ışın genişletici en pahalı olacak, ama Newport, Thor, ve çeşitli lazer üreticileri mükemmel kalitede ticari ışın genişleticiler sunmaktadır. Bazı lazer üreticileri de uygun maliyetli ve yerden tasarruf edilebilir, manuel ve elektronik kontrollü zayıflatıcılar sunuyoruz, ancak Glan-Thompson polarize ve yarım dalga plakası gibi çok yönlü değil. Ayrıca lazer nasıl kontrol etmek için karar vermeniz gerekir. Lazer şirket tarafından sağlanan ticari bir TTL jeneratör, ya da yazılım kullanmak, bir LabView tabanlı denetleyici tasarımı. Özel lazer üreticisi ile seçenekleri tartışın. çadır &quot;&gt; Biz biz genel bir kılavuz olarak sadece kullanılan var donanımın listesini sağlanan var. Bu sistem bizim mevcut görüntüleme sistemi eklendi zaman hakkında ABD doları 15.000 maliyet burada anlatılan. Sizin yerel Fizik bölümü çoğu zaman için bir pratik giriş sağlamak için istekli birine sahip olacak serbest ışını lazerler ile güvenli bir şekilde çalışıyor. Immobilizasyon ve zaman atlamalı görüntüleme C için alternatif yöntemler elegans son zamanlarda tarif edilmiştir. 14 Sorun Giderme En zor ve kritik bir adım mikroskop optik eksen merkezli genişletilmiş ışın uyum. Bir kere ışın merkezi nihai uyum için direksiyon aynalar kullanarak ÖNCE 5 um mikroskop optik eksen içinde hizalanır almak için çok çalışması gerektiğini Galile lensler ile merkezli ve genişletilmiş var. Mikroskop ışını hizalamak için direksiyon aynalar aşırı kullanımı, ışın ile eksen hareket edecekgenişletici. EXTREME DİKKAT KULLANARAK uygun ND filtre ile lazer ışını zayıflatır ve doğrudan bir yansıtıcı hedef (ön yüzeyi ayna) lazer ışın profili görebilirsiniz. (Demiryolu yüksekliğini ayarlamak için yukarı / aşağı aralığı merkezli edilememesi halinde) tam merkezinde 60X objektif alanında kiriş mikroskop hafifçe dürtmek yapabilirsiniz. Işın profili tam ortalanmış bir dairesel kiriş ve simetrik &quot;işaret fişekleri&quot; vermek için mikroskop optik eksene hizalamak için kullanılabilir. Asimetrik bir parlama mikroskop ekseni mükemmel uyumlu değildir (ya da raylı düz değil) olduğunu bir göstergesidir. Son olarak, L3 ayarlamak ve kiriş ve hatta simetrik bir genişleme ve daralma görmek gerekir. Sonra lazer ışını küçük bir noktaya odaklanmak için L3 ayarlamak Odak mikroskop ve hedef yüzeyinde tam. Artık lazer ışını LSCM veya CCD sistemi üzerinden görüntülü ve ablasyon nokta içinde 5 um merkezinin içinde olduğunu bulmak gerekirZ odak 1um. Eğer solucanlar &quot;havaya uçurmak&quot; ya da sürekli sorun büyük olasılıkla ablasyon lazer ince ayara aksonlar kesmek için büyük kavitasyon baloncukları üreten. En az (&lt;500nm) ablasyon yerinde Z odaklama (L3 lens ile yakınsama ayarlamak) ve XY güvene dayalı spot (son kinematik monte ayna ile ayarlamak) lokalize emin olun. Yüzeye yakın aksonlar Hedefleme daha az lazer güç gerektiren. Benzer şekilde, küçük hayvanlar (L1 ve L2) yetişkinler de aynı aksonlar hedeflemesine göre axotomy için daha az lazer güç gerektirir. Vahşi tip aksonlar rejenere veya aksonları çamaşır suyu yoksa, görüntüleme lazer gücünü azaltarak veya örnekleme oranı azalan denemelisiniz. Solucanları ölmek ya da kalırsanız sickly 1% adımlarla yüzde Agaroz azaltmayı deneyin. Başına yüksek kullanırken bu genellikle onları ölüme neden olacak gibi montaj solucanlar sonra lamel hareket etmiyor emin olun.Burada belirtilmesi gereken agaroz ve mikroküreler. Solucanlar time-lapse oturumu sırasında patlaması ya da ölürseniz nedeniyle: 1. Yüzde agaroz çok yüksek. 2. Hasar ablasyon lazer tarafından kütikülü. 3. Monte edildikten sonra lamel Hareketi. Manikür zarar hata ise sadece ablasyon lazer hedef olmuştur monte solucanlar etkileyecektir. Solucan time-lapse oturumu sırasında çok fazla hareket ederse,% 0.5 &#39;lik adımlarla yüzde agaroz artırmayı deneyin. Sağlıklı solucanlar Sağlıklı aksonlar her zaman &quot;aktif&quot; ve floresans tutarlı bir seviye göstergesi. , Floresan ya da aktivite ani bir düşüş görürseniz solucan ölüyor ya da öldü. Çoklu boncuklu veya parçalanmış aksonlar, ölüyor ya da ölü bir solucanın bir işaretidir. Tüm zaman atlamalı oturumu sırasında odak aksonlar tutmak sorun varsa birkaç farklı sorunları olabilir. İlk 10 saat boyunca bir bardak slayt görüntüleme inert bir örnek sahne sürüklenme kontrolrs. Birkaç mikron sürüklenme termal istikrarsızlık nedeniyle olabilir, ancak muhtemelen 5&#39;inden um mikroskop ile mekanik sorunları nedeniyle. Montaj ile ilgili sorunlar daha sık görülür. Zaman atlamalı başlamadan önce monte solucanlar 30 dakika için mikroskop aşaması ile muvazene edelim. Vazelin mühür zaman atlamalı oturumu sırasında sızıntıları geliştirmek olmadığını kontrol edin.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 535 nm Lazer </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (Teem, Kristal ve CRC de karşılaştırılabilir lazerlere) </td></tr><tr><td> Tüm optik ve donanım </td><td></td><td></td><td> (Thor karşılaştırılabilir optik ve donanım sunuyor) </td></tr><tr><td> Suprema Optik Mount, çapı 1.0 </td><td> Newport </td><td> SS100-F2KN </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap mesaj 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap yazılan çatal </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sıfır Sipariş Akromatik Wavel Tabak, yarım dalga Retardasyon, 400-700nm </td><td> Newport </td><td> 10RP52-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rotasyon Sahne, 1 &quot;Diyafram </td><td> Newport </td><td> RSP-1T </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap mesaj 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap yazılan çatal </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Glan-Lazer Kalsit Polarize, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polarize Rotasyon Dağı </td><td> Newport </td><td> RM25A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Çapı yazılan ¼ 1 &quot;ayırıcı&quot; </td><td> Newport </td><td> PS-0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ½ &quot;height, 1&quot; çap Mesaj </td><td> Newport </td><td> PS-0.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Çatal, 1 &quot;çap Mesaj </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Işın Dökümü </td><td> Newport </td><td> PL15 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç Lens Bayoneti </td><td> Newport </td><td> LH-OBJ1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap mesaj 1&quot; height </td><td> Newport </td><td> PS-1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 &quot;çap yazılan çatal </td><td> Newport </td><td> PS-F </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Yüksek Enerji Nd: YAG Lazer Ayna, 25,4 mm çap, 45 °, 532 nm </td><td> Newport </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Suprema Optik Mount, 1,0 inç çap, temizleme montaj deliği </td><td> Newport </td><td> SN100C-F </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Yüksek Hassas Knob Ayar Vidası, 12.7mm seyahat, 100TPI </td><td> Newport </td><td> AJS100-0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Konu adaptörü, ¼ -20 erkek, 8-32 kadın </td><td> Newport </td><td> SS-1-B </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1,5 inç çaplı çubuk için Rod Kelepçe </td><td> Newport </td><td> 340-RC </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Çubuk, uzun boylu 14 inç (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td&gt; <td> 1 </td></tr><tr><td> Raylı taşıyıcı X26, kare 40mm uzunlukta </td><td> Newport </td><td> CN26-40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Çelik Ray, 384mm (15 &quot;) uzunluk </td><td> Newport </td><td> X26-384 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1,5 inç çaplı çubuk Çubuk Platformu </td><td> Newport </td><td> 300-P </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Çubuk, uzun boylu 14 inç (35,5 cm) </td><td> Newport </td><td> 40 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Konkav Lens, 12.7 mm çap, 25mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plano-Konveks Lens, 25,4 mm çap, 50.2mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Plano-Konveks Lens, 25,4 mm çap, 62.9mm EFL, 430-700nm </td><td> Newport </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sabit Lens Mount, 0.5 &quot;çapında, 1.0&quot; Eksen yüksekliği </td><td> Newport </td><td> LH-0.5 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Lens Mount, 1.0 &quot;çapında, 1.0&quot; Eksen yüksekliği </td><td> Newport </td><td> LH-1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mikroküreler 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO konularda </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> Sigma </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in c. elegans

Time-lapse mikroskobu ile takip Lazer axotomy C ile akson rejenerasyonu fenotipleri için hassas bir testtir elegans 1. Bu testte temel zorluk, bir lazer ablasyon sistemi 2,3 uygulanması için gerekli olan algılanan maliyet ($ 25-100K) ve teknik uzmanlık. Ancak, mütevazı maliyetleri (&lt;$ 10K) solid-state darbe lazerler lazer ablasyon hedef aksonlar doku yüzeyine &quot;yakın&quot; şeffaf hazırlıkları için sağlam bir performans sağlayabilir. İnşaat ve hizalama bir sistem, bir gün içinde yapılabilir. Odaklanmış kondenser ablasyon lazer ışığı tarafından sağlanan optik yol, uygun bir uyum kılavuzu sağlar. Kaldırılır tüm optik ile bir ara modül ablasyon lazer adanmış ve lazer ablasyon oturumu sırasında herhangi bir optik elemanlar hareket gerekirse sağlar. Ara modül dikroik, eş zamanlı görüntüleme ve lazer ablasyon sağlar. Lazer ışını t Merkezlemeo odaklı mikroskop yoğunlaştırıcı lens ışın sistemi ilk uyum yönlendirir. Lensler çeşitli durum ve seçilen objektif lens arka diyafram doldurmak için kullanılan lazer ışını genişletmek. Final ön yüzeyi aynalı cam slayt hedefi ile uyum ve test yapılır. Lazer gücü minimum boyut ablasyon spot (&lt;1um) vermek için ayarlanır. Ablasyon nokta son kinematik monte ayna görüntüleme penceresinde sabit çapraz kıllar ince ayar ile ortalanır. Lazer güç axotomy için minimum hedef slayt (Bu kullandığınız hedef değişebilir) ablasyon nokta için gerekli olandan daha yüksek yaklaşık 10X olacaktır. Worms agaroz pedleri (veya mikroakışkan odaları 4) montaj, lazer axotomy ve time-lapse görüntüleme için immobilize olabilir . Agaroz pedleri mikrodalga erimiş dengeli tuz çözeltisi içinde% 10 agaroz ile kolayca yapılır. Bir damla erimiş agaroz cam bir slayt üzerine yerleştirilen ve başka bir ile düzleştirilmişbir yastık içine cam slayt kalınlığında yaklaşık 200 um (komşu slaytlar zaman bant, tek katmanlı bir boşluk bırakan olarak kullanılır). &quot;Sharpie&quot; kap, 13mm üniformalı bir çaplı dairesel bir ped kesmek için kullanılır. Anestezik (1ul Muscimol 20mm) ve Mikroküreler (Chris Fang-Yen kişisel iletişim) (1ul 2.65% Polistiren 0,1 um su), sol tarafta yatan böylece odaklı 3-5 solucanlar tarafından takip pad merkezine eklenir. Bir cam lamel uygulanır ve daha sonra vazelin lamel mühür ve örnek buharlaşmasını önlemek için kullanılır.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans at JoVE.com

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Lazer axotomy time-lapse görüntüleme mutasyonların etkileri de tahlil için hassas bir şekilde<em&gt; C. elegans</em&gt; Akson rejenerasyonu. Yüksek kaliteli, ama ucuz, lazer ablasyon sistemi en mikroskoplar kolayca eklenebilir. Time lapse görüntüleme 15 saat boyunca, solucan dikkatli immobilizasyon gerektirir.

Axon Rejenerasyon Eğitim Düşük bütçeli Lazer Axotomy Sistemi oluşturulması C. elegans</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Fetal Akciğer Hücrelerinde Mechanotransduction Okumak Deneysel Bir Sistem

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Lazer Bağlı Akson Lezyon sırasında Gerilim Film ölçümü Piconewton ve Milisaniye Çözünürlük de Yüzey için aksonal yapışma değerlendir

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Sıvılardaki Darbeli Lazer-Ablasyonuyla Metal Nanopartikül Üretimi: Nanopartiküllerin Antibakteriyel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Alet

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...