Name: a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch persönliche Stipendien aus dem Wellcome Trust an Beate Kampmann (056.608, GRO77273) finanziert.

1. Vorbereitung der BCG lux Reporter Mykobakterien Lager <ol><li> Wachsen BCG lux (M. bovis BCG Montreal Stamm mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 umgewandelt) unter Schütteln bei 200rpm bis Mitte logarithmischen Phase in Middlebrook 7H9-Bouillon mit 0,2% Glycerin, 0,05% zwischen 80 und 10% ADC Bereicherung. </li><li> Bereiten Sie 1 ml einer 1:10-Verdünnung von BCG lux Kultur in sterile PBS in einem Luminometer Rohr (900μl PBS + 100 &amp;mgr; BCG lux Kultur) in zweifacher Ausfertigung....

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	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind auch in Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Die erste Generation von Menschen bakterizide Assays wurden unter Verwendung Makrophagen allein, infiziert mit M. Tuberkulose. CFU diente als Haupt-Auslesen von Mykobakte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Cat No </td></tr><tr><td> BCG lux </td><td> Verschiedene </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11-Agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9-Bouillon </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC Bereicherung </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC ergänzen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-Decyl-Aldehyd </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Ethanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> Sterile PBS </td><td> In House </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 mit L-Glutamin, 25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Sterilem destilliertem Wasser </td><td> In House </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Ausstattung </td></tr><tr><td> Rohr Luminometer (injizierbare Port erforderlich) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 oder Einrohr-Luminometer Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer Röhren, 12 x 75mm, Pyrex randlose </td><td> Corning von VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer-Kolben mit belüfteten Kappen, sterile Polycarbonat 250ml </td><td> Corning über Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen (frei von Konservierungsmitteln Heparin) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml Falcon-Röhrchen, konisch </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin Probe Polypropylen bijou Rohre </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin Universal-Container (30 ml) </td><td> Laboratory Analysis LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Glasperlen 2mm Durchmesser </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml Pipetten und Pipettenspitzen Jungen </td><td> alle </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl und 200 ul Pipetten-und Filterspitzen </td><td> alle </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Allgemeine Laborausstattung: </td></tr><tr><td> Class II Sicherheitsschrank Schrank </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kühlschrank (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schüttler-Plattform (180 0) zu Röhrchen mischen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker Incubator Set bei 37 ° C für den Anbau von bis Bakterienkulturen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

Funktionale Tests sind seit langem eine wichtige Rolle bei der Messung der Immunogenität eines bestimmten Impfstoff gespielt. Dies wird üblicherweise als Serum bakterizide Titer ausgedrückt. Studium der Serum bakterizide Titer in Reaktion auf Impfstoffen für Kinder haben es uns zur Entwicklung und Validierung cut-off Werte für schützende Immunantworten und wie cut-offs sind in den Routineeinsatz. Keine solche Assays wurden nach vorne in die Routine Beurteilung von Impfstoffen, die vor allem die zellvermittelte Immunität in Form von Effektor-T-Zell-Reaktionen, wie z. B. TB-Impfstoffe induzieren genommen. Im Tiermodell ist die Leistung eines bestimmten Impfstoff routinemäßig in standardisierten bakterizide Assays ausgewertet und alle aktuellen Roman TB-Impfstoff-Kandidaten haben diesen Schritt in ihrer Auswertung wurden die vor dem 1. Humanstudien Phase unterzogen. Die Beurteilung der Immunogenität und damit die Wahrscheinlichkeit der Schutzwirkung von neuartigen Anti-TB-Impfstoffe sollten im Idealfall durchlaufen eine ähnliche stufenweise Auswertung in der menschlichen Modellen nun auch eine Bestimmung in bakterizide Assays. Bakterizide Assays im Rahmen der Tuberkulose Impfstoff-Forschung sind bereits gut in den Tiermodellen etabliert, wo sie angewendet werden, um potenziell vielversprechenden Impfstoffkandidaten Bildschirm. Reduzierung der bakteriellen Belastung in verschiedenen Organen Funktionen wie die wichtigsten Auslesen der Immunogenität. Es wurden jedoch keine solchen Tests in klinischen Studien für neue Anti-TB-Impfstoffe bisher einbezogen. Zwar gibt es noch Ungewissheit über die genauen Mechanismen, die von Mykobakterien in humanen Makrophagen töten führen, ist die Interaktion von Makrophagen und T-Zellen mit Mykobakterien eindeutig erforderlich. Der Test in diesem Papier beschrieben stellt eine neuartige Generation von bakterizide Assays, die Untersuchungen solcher Schlüssel zellulären Komponenten ermöglicht mit allen anderen zellulären und humoralen Faktoren, die in Vollblut ohne Annahmen bezüglich ihrer relativen individuellen Beitrag. Der Test von unserer Gruppe beschrieben werden kleine Mengen von Blut und hat bereits in Studien an Erwachsenen und Kindern in TB-endemischen Einstellungen eingesetzt. Wir haben Immunogenität des BCG-Impfstoffes gezeigt, erhöhtes Wachstum von Mykobakterien bei HIV-positiven Patienten, sowie die Wirkung von anti-retroviralen Therapie und Vitamin D auf Mykobakterien Überleben in vitro. Hier fassen wir die Methodik, und präsentieren Ihnen unsere Reproduzierbarkeit Daten mit diesem relativ einfachen, kostengünstigen und Feld-freundlichen Modell. Hinweis: Definitionen / Abkürzungen BCG lux = M. bovis BCG, Montreal Belastung, mit Shuttle-Plasmid pSMT1 Durchführung der luxAB Gene von Vibrio harveyi verwandelt, die unter der Kontrolle der Mykobakterien GroEL (Hsp60)-Promotor. KBE = Kolonie bildende Einheiten (ein Maß für Mykobakterien Lebensfähigkeit).

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von Mykobakterien<em&gt; In-vitro-</em&gt;, Die Reporter-Gen verwendet getaggt Mykobakterien statt Kolonie-bildenden Einheiten (KBE). &quot;Survival&quot; von Organismen sowie Host-Reaktion-Marker sind gleichzeitig gemessen Bereitstellung eines kostengünstigen, vielseitig und funktionsfähiges System für Untersuchungen der Wirt / Pathogen-Interaktionen im Rahmen der Tuberkulose.

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

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A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...