Name: a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר אישיים של קרן Wellcome כדי ביאטה Kampmann (056,608, GRO77273).

1. הכנת מלאי לוקס כתב BCG mycobacteria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול BCG לוקס (M. בוביס BCG זן מונטריאול הפך עם pSMT1 המעבורת פלסמיד) עם רעד בכל 200rpm לשלב אמצע לוגריתמי ב מידלברוק 7H9 מרק המכיל גליצרול 0.2%, 0.05% tween 80 ו - 10% העשרה ADC. </li><li style=";text-align:right;direction:...

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

מבחני bactericidal בהקשר של מחקר החיסון לשחפת מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. הדור הראשון של מבחני bactericidal א?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> חתול לא </td></tr><tr><td> BCG לוקס </td><td> שונים </td><td> n / a </td></tr><tr><td> מידלברוק אגר 7H11 </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> מידלברוק 7H9 מרק </td><td> BD Biosciences </td><td> 271,310 (500 גרם) </td></tr><tr><td> מידלברוק העשרה ADC </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> מידלברוק תוספת OADC </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> רוש </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-decyl אלדהיד </td><td> סיגמא </td><td> D7384-100 גרם </td></tr><tr><td> אתנול (&gt; 99.7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> סטרילי PBS </td><td> ב בית </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 עם L-גלוטמין, HEPES 25mm </td><td> סיגמא </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> מים מזוקקים מעוקרים </td><td> ב בית </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> ציוד </td></tr><tr><td> Tube luminometer (נמל בזריקות חובה) </td><td> ברטולד AutoLumat LB953 או יחיד צינור luminometer סיריוס </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer צינורות, 12 x 75mm, פיירקס נטולי מסגרת </td><td> קורנינג מ VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer צלוחיות עם כובעים פרקו, סטרילי פוליקרבונט 250 מ&quot;ל </td><td> קורנינג באמצעות פישר סיינטיפיק </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD אוסף Vacutainer צינורות דם (ללא חומר משמר הפרין) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> פלקון 50 מ&quot;ל צינורות, חרוטי </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin הדגימה פוליפרופילן תכשיט צינורות </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin יוניברסל מכולות (30 מ&quot;ל) </td><td> מעבדת ניתוח בע&quot;מ </td><td> 128C </td></tr><tr><td> חרוזי זכוכית בקוטר 2 מ&quot;מ </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל pipettes והילד פיפטה </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl ו 200μl pipettes וטיפים מסנן </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> כללי ציוד מעבדה: </td></tr><tr><td> Class II בטיחות ארון ארון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מקרר (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נדנדה שייקר פלטפורמה (180 0) לערבב צינורות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital שאכר החממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך גדל תרבויות חיידקי </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

מבחני פונקציונלית שיחקו זמן רב תפקיד מרכזי מדידה של immunogenicity של החיסון נתון. זה בא לידי ביטוי קונבנציונלית כמו titers bactericidal בסרום. מחקרים titers bactericidal בסרום בתגובה חיסונים בילדות אפשרו לנו לפתח לאמת חתוכים רמות המערכת החיסונית מגן כגון לחתוך-offs נמצאים בשימוש שגרתי. מבחני אין כאלה ננקטו קדימה לתוך הערכה שגרת חיסונים לגרום בעיקר התא בתיווך חסינות בדמות מפעיל התגובות תא T, כגון שחפת חיסונים. במודל חיה, הביצועים של מועמד חיסון נתון מוערך באופן שגרתי מבחני bactericidal סטנדרטית, וכל הנוכחית TB-חיסון מועמדים הרומן היה נתון בשלב זה להערכה שלהם לפני שלב 1 בניסויים בבני אדם. הערכת immunogenicity ולכן הסבירות של יעילות ההגנה של החיסון נגד שחפת רומן רצוי לעבור הערכה דומה צעד חכם של מודלים אנושיים עכשיו, כולל מדידות מבחני bactericidal. מבחני bactericidal בהקשר של מחקר חיסון שחפת כבר מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. עם זאת, אין מבחני כאלה שולבו ניסויים קליניים עבור חיסון נגד שחפת הרומן עד כה. אמנם יש עדיין אי ודאות לגבי המנגנונים המדויקים שהובילו להרג של mycobacteria בתוך מקרופאגים אדם, האינטראקציה של מקרופאגים ותאי T עם mycobacteria נדרש בבירור. Assay המתואר במאמר זה מייצג דור חדש של מבחני bactericidal המאפשר מחקרים כאלה רכיבים סלולריים מפתח עם כל הגורמים הסלולר הלחות אחרים הנמצאים בדם שלם מבלי לעשות הנחות על התרומה היחסית הפרט שלהם. Assay שתואר על ידי הקבוצה שלנו משתמשת בנפחים קטנים של דם שלם כבר המועסקים מחקרים על מבוגרים וילדים TB-אנדמיים הגדרות. הראינו immunogenicity של חיסון BCG, גדל צמיחה של mycobacteria ב חולי איידס, כמו גם את ההשפעה של טיפול אנטי retroviral וויטמין D על הישרדות mycobacterial במבחנה. כאן אנחנו מסכמים את המתודולוגיה, ולהציג נתונים reproducibility שלנו באמצעות מודל פשוט יחסית, בעלות נמוכה ושדה ידידותי. הערה: הגדרות / קיצורים BCG לוקס = M. בוביס BCG, זן במונטריאול, הפך עם pSMT1 מעבורת הפלסמיד נושא את הגנים luxAB מ Vibrio harveyi, תחת שליטה של GroEL mycobacterial (hsp60) מקדם. CFU = יחידת יצירת המושבה (מדד הכדאיות mycobacterial).

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של mycobacteria<em&gt; במבחנה</em&gt;, אשר משתמשת הכתב, גן מתויג mycobacteria במקום להרכיב המושבה יחידות (CFU). &quot;הישרדות&quot; של אורגניזמים כמו גם לארח בתגובה-סמנים נמדדים בעת ובעונה אחת, מתן בעלות נמוכה, מערכת תכליתי ופונקציונלי ללימודים של המארח / הפתוגן אינטראקציות בהקשר של שחפת.

Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...