Name: a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato da borse di studio personale del Wellcome Trust di Beate Kampmann (056.608, GRO77273).

1. Preparazione del giornalista BCG magazzino lux micobatteri <ol><li> Crescere BCG lux (M. bovis BCG ceppo Montreal trasformato con il plasmide pSMT1 navetta) con agitazione a 200gpm a metà logaritmica fase Middlebrook 7H9 brodo glicerolo contenente 0,2%, 0,05% Tween 80 e il 10% di arricchimento ADC. </li><li> Preparare 1 ml di una diluizione 1:10 di cultura BCG lux in PBS sterile in un tubo luminometro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) in duplice copia. </li><li> Carico prove...

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

Test battericida nel contesto della ricerca tubercolosi vaccino sono ben stabiliti nei modelli animali, dove sono applicati a schermo vaccini candidati potenzialmente promettenti. Riduzione della carica batterica nei vari organi funzioni come il principale lettura di immunogenicità. La prima generazione di umani test battericida sono stati progettati utilizzando macrofagi da solo, infettati con M. tubercolosi. CFU servita come principale lettura di sopravvivenza dei micobatteri dop...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Nessun gatto </td></tr><tr><td> BCG lux </td><td> Vari </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 brodo </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC arricchimento </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC supplemento </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-decile aldeide </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Etanolo (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> PBS sterile </td><td> In Casa </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 con L-Glutamina, HEPES 25mM </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Acqua distillata sterile </td><td> In Casa </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Tubo luminometro (porta iniettabili obbligatorio) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 o monotubo luminometro Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Tubi luminometro, 12 x 75mm, pyrex senza montatura </td><td> Corning VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Beute con tappi ventilati, sterile in policarbonato 250ml </td><td> Corning via Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer il prelievo di sangue Tubi (senza conservanti eparina) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> Provette Falcon da 50 ml, conico </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin campione tubi in polipropilene bijou </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin Contenitori universali (30 ml) </td><td> Laboratorio di Analisi LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Perle di vetro diametro di 2mm </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml pipette e ragazzo pipetta </td><td> qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl e 200μl pipette e puntali con filtro </td><td> qualsiasi </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Attrezzatura generale di laboratorio: </td></tr><tr><td> Classe II di sicurezza Armadio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Frigorifero (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rocking shaker piattaforma (180 0) miscelare tubi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Shaker orbitale incubatore a 37 ° C per crescere colture batteriche </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

Test funzionali hanno a lungo avuto un ruolo chiave nella misurazione di immunogenicità di un vaccino somministrato. Questo è convenzionalmente espresso in titoli battericida del siero. Studi di siero titoli battericida in risposta a vaccini per l&#39;infanzia ci hanno permesso di sviluppare e convalidare i livelli di cut-off per la risposta immunitaria protettiva e tale cut-off sono in uso di routine. Nessun tali analisi sono state prese in avanti nella valutazione di routine dei vaccini che inducono soprattutto immunità cellulo-mediata in forma di risposte delle cellule T effettrici, come i vaccini TB. Nel modello animale, le prestazioni di un candidato vaccino somministrato di routine è valutato in test standardizzati battericida, e tutti gli attuali romanzo TB-vaccino candidati sono stati sottoposti a questo passo nella loro valutazione prima della fase 1 sperimentazione umana. La valutazione di immunogenicità e quindi probabilità di efficacia protettiva del romanzo di vaccini anti-TBC dovrebbe idealmente subire una simile graduale valutazione nei modelli umani oggi, comprese le misurazioni in saggi battericida. Test battericida nel contesto della ricerca tubercolosi vaccino sono già ben radicate nei modelli animali, dove sono applicati a schermo vaccini candidati potenzialmente promettenti. Riduzione della carica batterica nei vari organi funzioni come il principale lettura di immunogenicità. Tuttavia, non tali dosaggi sono stati inseriti nella sperimentazione clinica per il romanzo anti-TB vaccini fino ad oggi. Anche se c&#39;è ancora incertezza circa i meccanismi esatti che portano alla morte dei micobatteri all&#39;interno dei macrofagi umani, l&#39;interazione dei macrofagi e delle cellule T con micobatteri è chiaramente necessario. Il dosaggio descritti in questo documento rappresenta una nuova generazione di test battericida che consente studi di tali componenti chiave cellulari con tutti gli altri fattori cellulari e umorali presenti nel sangue intero senza fare ipotesi sulla loro contributo relativo individuali. Il test descritto dal nostro gruppo utilizza piccoli volumi di sangue intero ed è già stato impiegato in studi di adulti e bambini in TB è endemica impostazioni. Abbiamo dimostrato immunogenicità del vaccino BCG, aumento della crescita dei micobatteri in pazienti sieropositivi, così come l&#39;effetto della terapia anti-retrovirale e vitamina D sulla sopravvivenza dei micobatteri in vitro. Qui riassumiamo la metodologia, e presentare i nostri dati riproducibilità utilizzando questo modello relativamente semplice, a basso costo e di campo-friendly. Nota: Definizioni / Abbreviazioni BCG lux = M. bovis BCG, ceppo Montreal, trasformato con il plasmide pSMT1 navetta che trasportano i geni luxAB dal Vibrio harveyi, sotto il controllo dei micobatteri GroEL (hsp60) promotore. UFC = unità formanti colonia (una misura della vitalità dei micobatteri).

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Abbiamo descritto un approccio alternativo alla enumerazione dei micobatteri<em&gt; In vitro</em&gt;, Che utilizza giornalista-gene tag micobatteri invece di unità formanti colonie (CFU). &quot;Sopravvivenza&quot; degli organismi così come risposta dell&#39;ospite-marcatori vengono misurati contemporaneamente, fornendo un basso costo, sistema versatile e funzionale per gli studi di host / patogeno interazioni nel contesto della tubercolosi.

Un test funzionale di sangue intero per misurare la vitalità dei micobatteri, utilizzando Reporter-Gene Tagged BCG o M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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Gli antigeni Protetto funzionali globuli rossi dalla membrana innesto di Compact Poligliceroli Hyperbranched

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Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

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