Name: a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00
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この作品は、ウェルカムトラストからベアテKampmann（056608、GRO77273）への個人的な奨学金によって賄われていた。

1。 BCG ルクスレポーターマイコバクテリア株の調製<ol><li> BCGを育てるルクスミドル7H9ブロス0.2％グリセロール、0.05％ツイーン80および10％のADCの濃縮を含むで中期対数期に200rpmで振盪しながら（シャトルプラスミドpSMT1で形質転換されたM.ボビス BCGモントリオール株）。 </li><li>重複のルミノメーターチューブに滅菌PBSでBCG ルクス文化（900μlPBS +100μlのBCG ルクス...

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。 人間の殺菌アッセイの第一世代はM.に感染し、単独でマクロファージを用いて設計され結核 。 CFUは、3週間の最小時間...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> 猫なし </td></tr><tr><td> BCG ルクス </td><td>様々な</td><td> N / A </td></tr><tr><td>ミドル7H11寒天培地</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 283810 </td></tr><tr><td>ミドル7H9ブロス</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 271310（500グラム） </td></tr><tr><td>ミドルADCの濃縮</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 212352 </td></tr><tr><td>ミドルOADCサプリメント</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80を</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 274364 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5150 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>ロッシュ</td><td> 10843555001（20ミリリットル） </td></tr><tr><td> N -デシルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> D7384 - 100G </td></tr><tr><td>エタノール（&gt; 99.7％） </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td>滅菌PBS </td><td>ハウスで</td><td> N / A </td></tr><tr><td> L -グルタミン、25mMのHEPESを含むRPMI - 1640 </td><td>シグマ</td><td> R0883 </td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td>ハウスで</td><td> N / A </td></tr><tr><td colspan="3"> 機器の </td></tr><tr><td>チューブルミノメーター（注射ポート必須） </td><td>ベルトルトAutoLumat LB953またはシングルチューブルミノメーターシリウス</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター用チューブ、12 × 75ミリメートル、パイレックス縁なしの</td><td> VWRからコーニング</td><td> 99445〜12 </td></tr><tr><td>ベントキャップ付き三角フラスコ、滅菌ポリカーボネート250ミリリットル</td><td>コー​​ニング経由フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BDバキュテイナ採血管（防腐剤フリーヘパリン） </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ミリリットルファルコンチューブ、円錐形の</td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ミリリットルSterilin試料ポリプロピレンビジューチューブ</td><td> VWR </td><td> 99445〜12 </td></tr><tr><td> Sterilinユニバーサル容器（30ml）に</td><td>実験室の分析LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td>ガラスビーズ直径2mm </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ミリリットルピペットとピペットの少年</td><td>あらゆる</td><td></td></tr><tr><td> 1000μlと200μlのピペットとフィルタのヒント</td><td>あらゆる</td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 一般的な実験装置： </td></tr><tr><td>クラスII安全キャビネットキャビネット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫（4℃） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブを混合するロッキングシェーカープラットフォーム（180 0） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカーインキュベーターは、細菌培養を成長させるため37℃に設定</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

機能アッセイは、長い間、特定のワクチンの免疫原性を測定する際に重要な役割を果たしてきました。これは、従来、血清殺菌力価として表されます。幼年期のワクチンへの応答における血清殺菌力価の研究は、防御免疫応答と、カットオフのためにカットオフレベルを開発し、検証するために私たちを有効にしているルーチンを使用しています。そのようなアッセイは、このような結核ワクチンなどのエフェクターT細胞応答の形で主に細胞性免疫を誘導するワクチンのルーチン評価に前方に取られている。動物モデルでは、与えられたワクチン候補のパフォーマンスは、日常的に標準化された殺菌アッセイで評価され、現在のすべての小説TB -ワクチン候補は、1人間の臨床試験を段階的に廃止する前に、彼らの評価では、この工程に供されています。免疫原性とそのため新規抗結核ワクチンの予防効果の可能性の評価は、理想的に殺菌アッセイで測定を含む、現在は人間のモデルに類似した段階的な評価を受けるべきである。 結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、既によく、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。しかし、そのようなアッセイは、これまでの新規抗結核ワクチンの臨床試験に組み込まれていません。 ヒトマクロファージ内部のマイコバクテリアの死滅につながる正確なメカニズムについての不確実性が依然としてあるものの、抗酸菌とマクロファージとT細胞の相互作用が明らかに必要です。このホワイトペーパーに記載のアッセイは、それらの相対的な個々の貢献についての仮定を行うことなく、全血中に存在するすべての他の細胞性および体液性因子とそのような重要な細胞成分の研究を可能にする殺菌アッセイの小説世代を表します。私たちのグループによって記述されるアッセイは、全血の少量を使用し、既に結核流行の設定で、大人と子供の研究で用いられている。我々は、BCGワクチンの免疫原性を示すHIV陽性患者におけるマイコバクテリアの成長だけでなく、in vitroでの抗酸菌の生存に対する抗レトロウイルス療法とビタミンDの効果を増加している。ここでは、方法論を要約し、そしてこの比較的単純な、低コストとフィールドフレンドリーなモデルを使用して、私たちの再現性のデータを提示する。 注：定義/略語 BCG ルクス = M.ウシ型 BCG、モントリオールの株は、抗酸菌のGroEL（HSP60）のプロモーターの制御下で、 ビブリオharveyiからluxAB遺伝子を有するシャトルプラスミドpSMT1で形質転換。 CFU =コロニー形成単位（マイコバクテリア生存率の測定）。

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

我々は、マイコバクテリアの列挙に​​別のアプローチを説明します<em&gt; in vitroで</emコロニー形成単位（CFU）の代わりに抗酸菌タグ付けされたレポーター遺伝子を使用する&gt;、。生物の&quot;生存&quot;だけでなく、宿主応答 - マーカーが結核のコンテキストでのホスト/病原体相互作用の研究のための低コスト、汎用性と機能的なシステムを提供し、同時に測定されています。

BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

定性的にオーバーレイアッセイを使用すると、肺炎球菌バクテリオシンに対する細菌の産生と感度を測定します

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...