Name: a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av personliga stipendier från Wellcome Trust till Beate Kampmann (056.608, GRO77273).

1. Beredning av BCG-lux reporter mykobakterier lager <ol><li> Grow BCG lux (M. bovis BCG Montreal stam förvandlas med rymdfärjan plasmiden pSMT1) med skakning på 200rpm till mitten av logaritmiska fas i Middlebrook 7H9 buljong innehåller 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 och 10% ADC anrikning. </li><li> Förbered 1 ml av en 1:10 spädning av BCG-lux kultur i sterila PBS i en luminometer rör (900μl PBS + 100μl BCG lux kultur) i två exemplar. </li><li> Ladda röret med N-decyl ald...

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

Bakteriedödande analyser i samband med tuberkulos vaccin forskningen är väl etablerat i djurmodeller, där de tillämpas på skärmen potentiellt lovande vaccinkandidater. Minskning av bakteriehalten i olika organ fungerar som de viktigaste avläsning av immunogenicitet. Den första generationen av mänskliga bakteriedödande analyser har utformats med hjälp av makrofager ensam, infekterade med M. tuberkulos. CFU var den viktigaste avläsning av mykobakteriell överlevnad efter ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Företag </td><td> Katt Nej </td></tr><tr><td> BCG-lux </td><td> Olika </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11-agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283.810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 buljong </td><td> BD Biosciences </td><td> 271.310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC anrikning </td><td> BD Biosciences </td><td> 212.352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC komplettera </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212.240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274.364 </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-decyl aldehyd </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Etanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101.077 </td></tr><tr><td> Sterila PBS </td><td> I House </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 med L-glutamin, 25mm HEPES </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Sterilt destillerat vatten </td><td> I House </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Utrustning </td></tr><tr><td> Tube luminometer (injicerbara port obligatoriskt) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 eller enrörs luminometer Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer rör, 12 x 75mm, Pyrex garnityr </td><td> Corning från VWR </td><td> 99.445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyerkolvar med ventilerade lock, sterila polykarbonat 250ml </td><td> Corning via Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer blodprovtagningsrör (utan konserveringsmedel heparin) </td><td> BD </td><td> 367.676 </td></tr><tr><td> 50ml Falcon rör, koniska </td><td> BD </td><td> 352.077 </td></tr><tr><td> 7ml STERILIN exemplar polypropylen bijou rör </td><td> VWR </td><td> 99.445-12 </td></tr><tr><td> STERILIN Universal behållare (30 ml) </td><td> Laboratorieanalys LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Glaspärlor 2mm diameter </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetter och pipett pojke </td><td> någon </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl och 200μl pipetter och filter tips </td><td> någon </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Allmän laboratorieutrustning: </td></tr><tr><td> Klass II säkerhetsbänk skåp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kylskåp (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugera </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rocking shaker plattform (180 0) för att blanda rören </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker inkubator inställd på 37 ° C växer upp bakteriekulturer </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

Funktionella analyser har länge spelat en nyckelroll i att mäta immunogenicitet av en viss vaccin. Detta är konventionellt uttryckt som serum bakteriedödande titrar. Studier av serum bakteriedödande titrar som svar på barnvacciner har gjort det möjligt för oss att utveckla och validera cut-off nivåer för skyddande immunsvar och sådant cut-off är i rutinmässig användning. Inga sådana analyser har tagits fram i rutinen bedömning av vacciner som inducerar främst cell-medierad immunitet i form av effektor T cells svar, såsom tuberkulos vacciner. I djurmodell, är resultatet av ett visst vaccin kandidat rutinmässigt utvärderas i standardiserade bakteriedödande analyser, och alla nuvarande nya tbc-vaccinkandidater har utsatts för detta steg i sin utvärdering före fas 1 försök på människa. Bedömningen av immunogenicitet och därmed sannolikheten för skyddande effekten av nya anti-tbc vaccin bör helst genomgå en liknande stegvis utvärdering i den mänskliga modeller nu, även mätningar i bakteriedödande analyser. Bakteriedödande analyser i samband med tuberkulos vaccin forskningen redan är väl etablerade i djurmodeller, där de tillämpas på skärmen potentiellt lovande vaccinkandidater. Minskning av bakteriehalten i olika organ fungerar som de viktigaste avläsning av immunogenicitet. Dock har inga sådana analyser införlivats i kliniska prövningar för nya anti-tbc vaccin hittills. Även om det fortfarande osäkerhet om de exakta mekanismer som leder till dödandet av mykobakterier inne mänskliga makrofager, är interaktionen mellan makrofager och T-celler med mykobakterier klart krävs. Analysen som beskrivs i detta dokument representerar en ny generation av bakteriedödande analyser som möjliggör studier av sådana viktiga cellulära komponenter med alla andra cellulära och humorala faktorer i helblod utan att göra antaganden om deras relativa individuella bidrag. Analysen beskrivs av vår grupp använder små mängder av blod och har redan använts i studier av vuxna och barn i TB-endemiska inställningar. Vi har visat immunogenicitet av BCG-vaccinet, ökad tillväxt av svamp inom HIV-positiva patienter, samt effekten av antiretroviral behandling och vitamin D på mykobakteriella överlevnad in vitro. Här kan vi sammanfatta metoden och presentera våra reproducerbarhet data med hjälp av denna relativt enkla, billiga och fält-vänlig modell. OBS: Definitioner / Förkortningar BCG-lux = M. bovis BCG, Montreal stam, förvandlas med skyttel plasmid pSMT1 bär luxAB gener från Vibrio harveyi, under kontroll av mykobakteriell GroEL (hsp60) promotor. CFU = Colony Forming enhet (ett mått på mykobakteriella bärkraft).

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Vi beskriver en alternativ metod till i uppräkningen av mykobakterier<em&gt; In vitro</em&gt;, Som använder reporter-genen taggade mykobakterier istället för kolonibildande enheter (CFU). &quot;Survival&quot; av organismer samt immunförsvar-markörer mäts samtidigt, vilket ger en låg kostnad, mångsidig och fungerande system för studier av värd / patogen interaktioner i samband med tuberkulos.

En funktionell helblodsanalys att mäta livskraft mykobakterier, med hjälp av Reporter-Gene taggade BCG eller M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserade flödescytometri analys för att mäta cytotoxisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Använda Overlay-analys för att Kvalitativt Mät Bakteriell Produktion av och känslighet för pneumokockinfektioner bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flödescytometriska metod för att mäta glukosupptag och glukostransportör uttryck för monocyt Subpopulationer i helblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Skyddande effekt och Pulmonary immunsvar efter subkutan och intranasal BCG Administration hos möss

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Användning av en monocyt Monolayer analys för att utvärdera Fcy-receptor-medierad fagocytos

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling funktionen av en bakteriell Effector från en icke-odlingsbar växtpatogen hjälp av en jäst två-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...