Name: a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

Bu çalışma, Wellcome Trust Beate Kampmann (056.608, GRO77273) için kişisel burslar tarafından finanse edildi.

1. BCG lüks muhabiri mikobakteriler stok hazırlanması <ol><li> BCG büyümeye lux Middlebrook 7H9 broth içeren% 0.2 gliserol,% 0.05 arasında 80 ve% 10 ADC zenginleştirme orta-logaritmik faz 200rpm az sallayarak (servis plazmid pSMT1 ile dönüştürülmüş M. bovis BCG Montreal suşu). </li><li> Luminometre çift tüp (900μl PBS + 100μl BCG lüks kültür) 1ml steril PBS BCG lüks kültür 1:10 seyreltme hazırlayın. </li><li> N-desil aldehit (luciferin enzim subs...

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri, hayvan modellerinde de kurulmuştur. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması. M. enfekte insan bakterisidal testlerinin ilk nesil, tek başına makrofajlar kullanılarak dizayn edilmiştir tüberküloz. CFU, en az 3 haftalık bir süre sonra ana mikobakteriyel hayatta kalma o...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Kedi yok </td></tr><tr><td> BCG aşısı lüks </td><td> Çeşitli </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 broth </td><td> BD Biosciences </td><td> 271.310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC zenginleştirme </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC takviyesi </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-desil aldehit </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Etanol (% 99,7) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> Steril PBS </td><td> House </td><td> n / a </td></tr><tr><td> L-Glutamin, 25mm Hepes RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Steril distile Su </td><td> House </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Ekipman </td></tr><tr><td> Tüp luminometre (enjektabl port zorunlu) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 veya tek tüp luminometre Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminometre tüpler, 12 x 75mm, pyrex çerçevesiz </td><td> VWR gelen Corning </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Bacalı kapakları Erlenmeyer şişeler, steril polikarbonat 250ml </td><td> Corning üzerinden Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Kan Alma Tüpleri (koruyucu madde içermeyen heparin) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml Falcon tüpleri, konik </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml STERILIN örnek polipropilen küçük ama borular </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> STERILIN Evrensel konteynerler (30 ml) </td><td> Laboratuar Analiz LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Cam boncuklar 2mm çaplı </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml pipet ve pipet çocuk </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl ve 200μl pipetler ve filtre ipuçları </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Genel laboratuvar ekipmanları: </td></tr><tr><td> Sınıf II güvenlik kabini kabin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buzdolabı (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tüpler karıştırmak için Rocking çalkalayıcı platformu (180 0) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı inkübatör bakteri kültürleri büyüyen 37 ° C&#39;de </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

Fonksiyonel testlerin uzun süre belirli bir aşı immünojenite ölçme önemli bir rol oynamıştır. Bu, geleneksel serum bakterisidal titreleri olarak ifade edilir. Çocukluk aşıları yanıt serum bakterisidal titreleri çalışmaları rutin olarak kullanılması, koruyucu bağışıklık yanıtlarını ve bu cut-off için seviyelerini geliştirmek ve cut-off doğrulamak sağlamıştır. Testler TB aşıları gibi efektör T hücre yanıtları şeklinde öncelikle hücre-aracılı bağışıklık neden olan aşıların rutin değerlendirme içine ileri atılmıştır. Hayvan modeli, belirli bir aşı adayı performans rutin standart bakterisidal tayinlerde değerlendirilir ve mevcut tüm roman TB aşı adayı 1 insan çalışmalarda faz önce bu adımı değerlendirilmesi maruz kalmış. Immünojenite ve bu nedenle yeni anti-TB aşıların koruyucu etkinlik olasılığını değerlendirme ideal bakterisidal testleri ölçümleri de dahil olmak üzere, insan modelleri benzer bir adım akıllıca değerlendirme geçmelidir. Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri zaten iyi, hayvan modellerinde yılında kurulmuş olan. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması. Ancak, bugüne kadar yeni anti-TB aşıları için böyle testleri klinik çalışmalarda içine dahil edilmiştir. Mikobakterilerin insan makrofaj içinde öldürülmesi neden tam mekanizmaları hakkında belirsizlik hala var olmasına rağmen, mikobakteriler ile makrofaj ve T hücrelerinin etkileşimi açıkça gereklidir. Bu yazıda anlatılan testi onların göreceli bireysel katkı hakkında varsayımlar yapmadan tam kan mevcut diğer tüm hücresel ve humoral faktörler gibi temel hücresel bileşenleri çalışmaları sağlar bakterisidal testlerinin bir roman neslini temsil ediyor. Grubumuz tarafından açıklanan tam kan tahlil küçük hacimlerde kullanır ve zaten TB-endemik ayarları yetişkinler ve çocuklar çalışmalarda istihdam edilmiştir. Biz, BCG aşısı immünojenite gösterilen mikobakterilerin büyüme, HIV-pozitif hastalarda mikobakteriyel sağkalım üzerine in vitro anti-retroviral tedavi ve D vitamini etkisinin yanı sıra artmıştır. Burada metodoloji özetlemekte ve bu nispeten basit, düşük maliyetli ve sahada dostu bir model kullanarak tekrarlanabilirlik veri mevcut. Not: Tanımlar / Kısaltmalar BCG lux = M. bovis BCG, Montreal gerilme, mikobakteriyel GroEL (hsp60) promotör kontrolü altında, Vibrio harveyi luxAB genleri taşıyan servis plazmid pSMT1 dönüştürdü. CFU = Koloni Oluşturan Birim (mikobakteriyel canlılığının bir önlem).

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Mikobakterilerin numaralandırma için alternatif bir yaklaşım tarif<em&gt; In vitro</em, Muhabir-gen kullanan&gt; yerine koloni oluşturan birim (CFU) mikobakteriler etiketli. Organizmalar &quot;Survival&quot; gibi bir konak cevabı belirteçler tüberküloz bağlamda ev sahibi / patojen etkileşimleri çalışmaları için düşük maliyetli, çok yönlü ve fonksiyonel bir sistem, aynı anda ölçülür.

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Receptor-mediated Phagocytosis

Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...