Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعهد Morgridge للبحوث وجامعة ولاية ويسكونسن مؤسسة. نشكر كريستا إيستمان للمساعدة التحرير.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

الكتاب يكشف ان جات هو مؤسس ، حاملي الأسهم ، ومستشار وعضو مجلس الخلوية حيوية الدولية (CDI). وهو يشغل أيضا منصب المستشار العلمي لديها مصالح مالية والثانية في المشاريع التكتيك الخلايا الجذعية.

البروتوكولات الحالية لجعل المكتبات نهاية الاقتران تتطلب ما بين 1 ميكروغرام 9-2،5 10 ميكروغرام كمية بدءا من الحمض النووي الريبي الإجمالي. نحن هنا حاضرنا التضخيم T7 خطية إلى (T7LA) طريقة واحدة لإعداد كلا البورشيد نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التسلسل وتبين أن هذا الأسلوب يسمح للمكتبات من الجيل منخفضة تصل إلى 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع إنتاج البيانات التي يمكن أن تقارن من تضخيم الحد الأدنى (MinAmp) مصنوعة من مواد المكتبات أضعاف بدءا من 1000 (10 ميكروغرام RNA المجموع). المكتبات 10 نانوغرام لم يحدد فقط العدد الإجمالي للجينات مماثلة ، ولكن أيضا إنتاج التوقيعات التعبير الجيني التي تشبه (أرقام 3a و ب). وعلاوة على ذلك ، فإن كلا من واحدة نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التي تنتجها T7LA طريقة مشابهة جدا لبعضها البعض (الشكل 3C) ، الذي يسمح للباحثين لمقارنة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل المكتبات إما مصنوعة من البروتوكول. منذ أعدت هذه المكتبات من الحمض النووي الريبي الجنينية البشرية الخلايا الجذعية ، بحثنالمدة 30 جينات الخلايا الجذعية محددة بين المكتبات وجدت أن ما يقرب من تحديد جميع هذه الجينات (93-100 ٪) من المكتبات مصنوعة من لا يقل عن 10 نانوغرام من بدء RNA الكلي (الشكل 4) ، والمصادقة على البروتوكول وبالتالي لدينا. نعتقد بروتوكول لدينا ستكون مفيدة جدا للباحثين ، وخاصة في ظروف مثل الخلايا التي تم فرزها أو تدفق الليزر الدقيقة تشريح الأنسجة حيث بدأ يحد من المواد. في مثل هذه الظروف ، سيكون لدينا بروتوكول يسمح توليد بيانات قابلة للمقارنة في التعبير الجيني للمكتبات مصنوعة من كميات أكبر من ذلك بكثير منذ بدء بروتوكول لدينا تنتج ملامح التعبير للمقارنة بين ما لا يقل عن 3 أوامر من حجم بدءا من الحمض النووي الريبي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> شركة </td><td> طقم / الكاشف </td><td> كتالوج # </td><td> تعليقات خاصة </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> التفتت كاشف </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> بطانة الأكريلاميد </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 كيت </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC غير المعالجة nuclease المياه مجانا </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> تعيين dNTP </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> ميثليته dNTPs </td><td> R0431 </td><td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> TruSeq ريال الكتلة انشاء عدة V5 </td><td> GD - 203 - 5001 </td><td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> TruSeq تسلسل عدة دورات V5 36 </td><td> FC - 104 - 5001 </td><td></td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> رقاقة تسلسل نموذج الإعدادية كيت </td><td> IP - 102 - 1001 </td&gt; <td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط. ويمكن الاستعاضة عنها ميكس NEB عينة من الحمض النووي ماجستير الإعدادية مجموعة 1 القط # E6040S </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> TruSeq PE الكتلة انشاء عدة V5 </td><td> PE - 203 - 5001 </td><td> لإقران نهاية الإعدادية عينة فقط </td></tr><tr><td> البورشيد </td><td> إقران طقم نهاية نموذج الإعدادية </td><td> PE - 102 - 1001 </td><td> لإقران نهاية الإعدادية عينة فقط </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB زائد سلم </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> كولاي ريبونوكلياز H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ريبونوكلياز خارج </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2 العازلة حبلا 5X </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> هاء القولونية بوليميريز الحامض النووي </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E - هلام SYBR آمنة 2 ٪ </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> أنا مرتفعالثاني (مع العازلة FS 5X و0.1M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit مقايسة طقم </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS و qubit مقايسة طقم </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> كولاي DNA يغاز </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 بوليميراز الدنا </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ماء نقي جدا الدناز ريبونوكلياز </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ثانيا مرتفع مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل عدة توليف [كدنا] </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> عشوائي التمهيدي (invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> لإقران نهاية الإعدادية عينة فقط </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B التمهيدي </td><td> N / A </td><td> لقراءة واحدة سامالتنوير القائل الإعدادية فقط </td></tr><tr><td> IDT </td><td> أليغو DT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 الهضم عدة </td><td> R0189S </td><td> لعينة واحدة الإعدادية للقراءة فقط </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute طقم </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy ميني كيت (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> هلام تنقية عدة </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> تعيين الدناز </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute طقم </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> الإنزيم بحوث </td><td> الحمض النووي نظيفة والمكثف (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

يستخدم الآن كله التسلسل transcriptome بواسطة تسلسل - مرنا على نطاق واسع لأداء عالمية التعبير الجيني ، الطفرة ، أليل محددة التعبير وغيرها من التحليلات الجينوم واسعة. تسلسل مرنا ، حتى يفتح الباب لتحليل التعبير الجيني للمورثات غير متسلسلة. مرنا ، يقدم تسلسل حساسية عالية ، ومجموعة كبيرة ديناميكية ويسمح بقياس الأرقام نسخ النص في العينة. البورشيد في الجينوم محلل يؤدي تسلسل لعدد كبير (&gt; 10 7) من سلسلة قصيرة نسبيا يقرأ (&lt;150 BP) ، والتسلسل و&quot;إقران نهاية&quot; النهج ، وفيه قراءة واحدة طويلة في كل أهدافها ، ويسمح لتعقب التقاطعات لصق بديل ، الإدراج والحذف ، ومفيد لتجميع دي transcriptome نوفو. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الباحثين هو كمية محدودة من المواد ابتداء. على سبيل المثال ، في التجارب حيث يتم حصاد الخلايا بواسطة الليزر الدقيقة تشريح المتاحة بدءا مجموع RNA مالمنعم يوسف في قياس نانوجرام. وقد وصفت إعداد تسلسل مرنا - المكتبات من مثل هذه العينات 1 ، 2 ولكن ينطوي كبيرة PCR التضخيم التي قد أعرض عن التحيز. وقد نشرت الأخرى بناء مكتبة الرنا تسلسل الإجراءات مع الحد الأدنى من التضخيم PCR 3 ، 4 ، ولكنها تتطلب كميات ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ابتداء الإجمالي. نحن هنا وصف بروتوكول لمنصة الجينوم محلل البورشيد الثاني لتسلسل تسلسل مرنا ، لإعداد المكتبة التي تتجنب كبيرة PCR التضخيم ويتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي الإجمالي. في حين وصفت في وقت سابق هذا البروتوكول والمصادقة على واحد في نهاية التسلسل 5 ، حيث تم عرض لانتاج مكتبات الاتجاه دون إدخال كبيرة التحيز التضخيم ، نحن هنا من صحة أكثر من ذلك لاستخدامها بوصفها بروتوكول نهاية المقترنة. نحن تضخيم انتقائي الرناوات رسول مذيل بعديد الأدينيلات بدءا من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الأسلوب يستند T7 Eberwine التضخيم الخطية ، صاغ &quot;T7لوس انجليس &quot;(T7 خطية التضخيم) ، وتضخيم بولي - A مجزأة mRNAs ، عكس كتب ومحول ligated لإنتاج مكتبة التسلسل النهائي. بالنسبة لكل من يعمل واحد نهاية القراءة والمقترنة ، يتم تعيينها لسلاسل transcriptome الإنسان (6) وتطبيع بحيث ويمكن مقارنة البيانات من تشغيل متعددة ، ونحن التقرير قياس التعبير الجيني في وحدات من النصوص لكل مليون (TPM) ، وهو مقياس متفوقة على RPKM عند مقارنة عينات 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

نحن هنا وصف طريقة لتحضير كل واحد المكتبات نهاية القراءة ومرنا ، المقترنة تسلسل البورشيد التسلسل الجيني للتحليل بناء على تضخيم الحمض النووي الريبي T7 الخطية. هذا البروتوكول لا يتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي ابتداء مجموع المكتبات ويولد متسقة للغاية تمثل النصوص كلها.

قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

الكروماتين تحليل التفاعل مع تسلسل العلامات المقترنة النهائي (شيا-PET) لرسم خرائط التفاعلات الكروماتين وفهم تنظيم النسخ

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 &#39;نهاية الشق من قبل مرنا ركائز<em&gt; في المختبر</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

عزل النوى من كلية الفأر البالغة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...