Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra Morgridge Institut for Forskning og University of Wisconsin Foundation. Vi takker Krista Eastman til redaktionel assistance.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Forfatterne afslører, at JAT er en grundlægger, stockowner, konsulent og medlem af bestyrelsen for Cellulær Dynamics International (CDI). Han fungerer også som videnskabelig rådgiver for og har økonomiske interesser i Taktik II Stem Cell Ventures.

Nuværende protokoller for at gøre parret slutningen biblioteker kræver mellem 1 mikrogram 9 til 2,5 mikrogram 10 grundbeløbet for total RNA. Her præsenterer vi vores lineære T7 forstærkning baseret (T7LA) metode til at forberede både enkelt læser og parret slutningen Illumina sekventering biblioteker og vise, at denne metode gør det muligt generation af biblioteker fra så lavt som 10 ng af total RNA, der producerer data, der er sammenlignelig med minimalt forstærket (MinAmp) biblioteker lavet fra 1000 gange mere udgangsmaterialet (10 mikrogram total RNA). De 10 ng biblioteker ikke kun identificere lignende samlede antal gener, men også producere genekspression signaturer, der er ens (figur 3a og b). Desuden er både den enkelte læser og parret slutningen biblioteker produceret af T7LA metode er meget lig hinanden (figur 3c), som gør det muligt for forskerne at sammenligne data genereret af biblioteker lavet af enten protokol. Da disse biblioteker var beredt fra humane embryonale stamceller RNA, vi søgtefor 30 stamceller specifikke gener blandt de biblioteker og finde, at næsten alle disse gener (93-100%) er identificeret ved de biblioteker fremstillet af mindst 10 ng om at starte total RNA (figur 4), og dermed validere vores protokol. Vi mener, at vores protokollen ville være meget nyttigt for forskere, især i en situation som flow sorteret celler eller laser-, mikro-dissekerede væv, hvor udgangsmaterialet er begrænsende. Under sådanne omstændigheder ville vores protokol tillader generation af genekspression data kan sammenlignes med biblioteker lavet af meget større starte mængder, da vores protokol giver udtryk profiler sammenlignelige på tværs af mindst 3 størrelsesordener at starte RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Firma </td><td> Kit / Reagens </td><td> Katalog # </td><td> Særlige bemærkninger </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentering reagens </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Akrylamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Ikke DEPC behandlet nuklease frit vand </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP sæt </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> methylerede dNTP&#39;er </td><td> R0431 </td><td> For enlige Læs prøve prep kun </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> For enlige Læs prøve prep kun </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cykler </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> For enlige Læs prøve prep alene. Kan erstattes med de nationale myndigheder DNA-prøve prep Master Mix Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> For parret slutningen prøve prep kun </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Forbundne Slut Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> For parret slutningen prøve prep kun </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB plus stigen </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2. Strand buffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-polymerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR sikker 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Hævet JegII (med 5X FS buffer og 0.1M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit assay kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit assay kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA-polymerase </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure DNase RNase vand </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Hævet II dobbelt strandede cDNA syntese kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Tilfældige Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> For parret slutningen prøve prep kun </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B primer </td><td> N / A </td><td> For enlige Læs SamPLE prep kun </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 fordøjelsen kit </td><td> R0189S </td><td> For enlige Læs prøve prep kun </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel rensning kit </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase sæt </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> ZymoGenetics Forskning </td><td> DNA ren og koncentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Hele transkriptom sekventering af mRNA-Seq er nu udbredt til at udføre globale genekspression, mutation, allel-specifikke udtryk og andre genom-dækkende analyser. mRNA-Seq selv åbner porten for genekspression analyse af ikke-sekventeret genomer. mRNA-Seq byder på høj følsomhed, et stort dynamikområde og tillader måling af udskrift kopiere numre i en prøve. Illumina er Genome Analyzer udfører sekventering af et stort antal (&gt; 10 7) af relativt kort sekvens læser (&lt;150 bp). Den &quot;parrede ende&quot; tilgang, hvori en enkelt lang læse er sekventeret i begge dens ender, giver mulighed for sporing af alternativ splejsning vejkryds , indsættelser og sletninger, og er nyttigt for de novo transkriptom forsamling. En af de største udfordringer, som forskere er en begrænset mængde af udgangsmateriale. For eksempel starter i eksperimenter, hvor celler høstes ved hjælp af laser mikro-dissektion, samlede disponible RNA may foranstaltning i nanogram. Udarbejdelse af mRNA-Seq biblioteker fra sådanne prøver er blevet beskrevet 1, 2, men indebærer betydelige PCR-forstærkning, der kan introducere bias. Andre RNA-Seq bibliotek konstruktion procedurer med minimal PCR-amplifikation er blevet offentliggjort 3, 4, men kræver mikrogram mængder af startende total RNA. Her beskriver vi en protokol for Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sekventering for bibliotek forberedelse, der undgår betydelige PCR amplifikation og kræver kun 10 nanogram af total RNA. Mens denne protokol er blevet beskrevet tidligere, og valideres for enkelt-ende sekventering 5, hvor det viste sig at producere retningsbestemt biblioteker uden at indføre væsentlig forstærkning bias, her har vi validere den videre til brug som en parret ende protokol. Vi selektivt at forstærke polyadenylated messenger RNA fra at starte total RNA ved hjælp af T7 baseret Eberwine lineær forstærkning metode, opfundet &quot;T7LA &quot;(T7 lineær forstærkning). Det forstærkede poly-A mRNA er fragmenterede, reverse transkriberet og adapter ligated at producere det endelige rækkefølge biblioteket. For både enkelt læser og parret ende kører, er sekvenser knyttet til den menneskelige transkriptom 6 og normaliseret, således at data fra flere kørsler kan sammenlignes. Vi rapporterer genekspression måling i enheder af afskrifter per million (TPM), som er en overlegen foranstaltning til RPKM, når man sammenligner prøver 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Her beskriver vi en metode til klargøring af både enkelt læser og parret ende Illumina mRNA-Seq sekvensering biblioteker til genekspressionsanalyse baseret på T7 lineær RNA forstærkning. Denne protokol kræver kun 10 nanogram at starte total RNA og genererer meget konsekvent biblioteker repræsenterer hele udskrifter.

Enkelt Læs og Forbundne End mRNA-Seq Illumina Biblioteker fra 10 nanogram Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transskription og lukning af Gaussia luciferase-mRNA Efterfulgt af HeLa Celletransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analyse af RNA Processing Reaktioner Brug Cell Free Systems: 3 &#39;End spaltning af præ-mRNA Underlag<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Celle-Type-specifikke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kerneisolering fra voksen musenyre til RNA-sekventering med en kerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering og transkriptomanalyse af plantecelletyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...