Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door financiering uit het Morgridge Instituut voor Onderzoek en de Universiteit van Wisconsin Foundation. Wij danken Krista Eastman voor redactionele ondersteuning.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

De auteurs beschrijven dat JAT is een oprichter, stockowner, adviseur en bestuurslid van Cellular Dynamics International (CDI). Hij fungeert ook als wetenschappelijk adviseur en heeft financiële belangen in Tactics II Stem Cell Ventures.

Huidige protocollen voor het maken van gekoppelde eind bibliotheken vereisen tussen 1 ug 9 tot 2,5 microgram 10 basisbedrag van totaal RNA. Hier presenteren we onze lineaire T7 versterking op basis van (T7LA) methode om zowel de single lezen en is afgestemd op het einde Illumina-sequencing bibliotheken en tonen voor te bereiden dat deze methode maakt het mogelijk genereren van bibliotheken uit zo laag als 10 ng totaal RNA, het produceren van gegevens die vergelijkbaar is met dat van minimaal versterkt (MinAmp) bibliotheken gemaakt van een factor 1000 meer uitgangsmateriaal (10 ug totaal RNA). De 10 ng bibliotheken niet alleen identificeren vergelijkbaar totaal aantal genen, maar produceren ook genexpressie handtekeningen die vergelijkbaar zijn met (de figuren 3a en b). Bovendien zijn zowel de single te lezen en is afgestemd op het einde bibliotheken geproduceerd door de T7LA methode zijn erg op elkaar lijken (figuur 3c), waarmee onderzoekers te vergelijken gegevens die worden gegenereerd door bibliotheken gemaakt van een protocol. Aangezien deze bibliotheken werden bereid uit menselijke embryonale stamcellen RNA, zochten we naarvoor 30 stamcel specifieke genen bij de bibliotheken en vind dat bijna al deze genen (93-100%) zijn geïdentificeerd door de bibliotheken gemaakt van ten minste 10 ng van het starten van totaal RNA (figuur 4), waardoor het valideren van ons protocol. Wij geloven dat ons protocol zou zeer nuttig zijn voor onderzoekers, vooral in omstandigheden zoals stroom gesorteerd cellen of laser-, micro-ontleed weefsel waar de grondstof is beperkt. In dergelijke omstandigheden zou ons protocol laten generatie van genexpressie data te vergelijken met bibliotheken gemaakt van veel grotere hoeveelheden te beginnen, omdat ons protocol produceert expressie profielen vergelijkbaar zijn tussen minstens drie ordes van grootte van het starten van RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Vennootschap </td><td> Kit / Reagens </td><td> Catalog # </td><td> Bijzondere opmerkingen </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentatie reagens </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrylamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Niet DEPC behandeld nuclease gratis water </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> gemethyleerd dNTPs </td><td> R0431 </td><td> Voor Single Lees sample prep alleen </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Voor Single Lees sample prep alleen </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cycli </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Voor Single Lees sample prep alleen. Kan worden vervangen met de nationale handhavingsinstanties DNA-monster prep Master Mix Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Voor gepaarde einde sample prep alleen </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Gepaarde Einde Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Voor gepaarde einde sample prep alleen </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB plus ladder </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2e streng buffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-polymerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR safe 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript III (met 5x FS buffer en 0,1 M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> TRIzol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit testkit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit testkit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA-polymerase </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure Dnase RNase water </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript II dubbelstrengs cDNA synthese kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Random Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Voor gepaarde einde sample prep alleen </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B primer </td><td> N / A </td><td> Voor Single Lees samPLE prep alleen </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 spijsvertering kit </td><td> R0189S </td><td> Voor Single Lees sample prep alleen </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel zuivering kit </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Onderzoek </td><td> DNA schoon en concentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Hele transcriptoom sequentiebepaling door mRNA-Seq wordt nu op grote schaal gebruikt om globale gen-expressie, mutatie, allel-specifieke expressie en andere genoom-brede analyses uit te voeren. mRNA-Seq opent ook de poort voor genexpressie analyse van niet-gesequenced genoom. mRNA-Seq biedt een hoge gevoeligheid, een groot dynamisch bereik en maakt het meten van transcript kopie nummers in een monster. Illumina&#39;s genoom analyse voert sequencen van een groot aantal (&gt; 10 7) van de relatief korte reeks leest (&lt;150 bp). De &#39;gepaarde end &quot;-benadering, waarin een enkele lange lezen is gesequenced aan beide de uiteinden, maakt voor het volgen van alternatieve splice knooppunten , inserties en deleties, en is nuttig voor de novo transcriptoom montage. Een van de belangrijkste uitdagingen voor onderzoekers is een beperkte hoeveelheid uitgangsmateriaal. Bijvoorbeeld, in experimenten waarbij cellen worden geoogst met behulp van laser micro-dissectie, beschikbaar vanaf totaal RNA may te meten in nanogram. Voorbereiding van de mRNA-Seq bibliotheken van dergelijke monsters zijn beschreven 1, 2 maar brengt grote PCR-amplificatie, dat kan invoeren bias. Andere RNA-Seq bibliotheek constructie met een minimum aan procedures PCR-amplificatie zijn gepubliceerd 3, 4 maar vereisen microgram hoeveelheden van het starten van totaal RNA. Hier beschrijven we een protocol voor de Illumina Genome Analyzer II-platform voor mRNA-Seq sequencing voor bibliotheek voorbereiding die belangrijk PCR-amplificatie vermijdt en vereist slechts 10 nanogram totaal RNA. Hoewel dit protocol is eerder beschreven en gevalideerd voor single-end sequencing 5, waar het werd aangetoond dat directionele bibliotheken te produceren zonder invoering van aanzienlijke versterking bias, hier zijn we verder valideren voor gebruik als een gekoppelde end protocol. We selectief versterken gepolyadenyleerde messenger RNA&#39;s kan starten totaal RNA met behulp van de T7-gebaseerde Eberwine lineaire versterking methode, bedacht &quot;T7LA &quot;(T7 lineaire versterking). De geamplificeerde poly-A mRNA&#39;s zijn gefragmenteerd, reverse getranscribeerd en adapter geligeerd aan de uiteindelijke volgorde bibliotheek te maken. Voor zowel de single lezen en gekoppeld einde loopt, sequenties worden toegewezen aan de menselijke transcriptoom 6 en zodat genormaliseerde Gegevens uit meerdere runs kunnen worden vergeleken. We verslag van de genexpressie gemeten in eenheden van transcripten per miljoen (TPM), die een superieure maatregel om RPKM bij het ​​vergelijken van samples 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Hier beschrijven we een methode voor de bereiding van zowel de single lezen en gekoppeld end Illumina mRNA-Seq sequencing bibliotheken voor genexpressie analyse op basis van T7-RNA lineaire versterking. Dit protocol vereist slechts 10 nanogram van het starten van totaal RNA en genereert een uiterst consistente bibliotheken vertegenwoordigt hele transcripten.

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

RNA-extractie uit Neuroprecursor cellen met behulp van de Bio-Rad Totaal RNA Kit

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 &#39;End Splitsing van pre-mRNA Substrates<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-Type-specifieke Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...