Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
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Ce travail a été soutenu par un financement de l&#39;Institut de recherche et d&#39;Morgridge l&#39;Université du Wisconsin Foundation. Nous tenons à remercier Krista Eastman pour son assistance éditoriale.

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	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Les auteurs révéler que JAT est un fondateur, stockowner, consultant et membre du conseil de la dynamique cellulaire international (CDI). Il est aussi conseiller scientifique et a des intérêts financiers dans Ventures II Tactiques de cellules souches.

Les protocoles actuels pour rendre les bibliothèques fin jumelé nécessitent entre 1 ug de 9 à 2,5 mg 10 montant de départ de l&#39;ARN total. Ici, nous présentons nos amplification linéaire basée T7 (T7LA) méthode pour préparer à la fois simple lecture et les bibliothèques jumelé Illumina fin de séquençage et montrent que cette méthode permet la génération de bibliothèques d&#39;aussi peu que 10 ng d&#39;ARN total, la production de données qui est comparable à celle de minimalement amplifiées (MinAmp) fabriqués à partir de 1000 bibliothèques du matériel fois plus de départ (10 ug d&#39;ARN totaux). Les 10 bibliothèques ng non seulement identifier similaires du nombre total de gènes, mais aussi de produire des signatures d&#39;expression génique qui sont similaires (figures 3a et b). Par ailleurs, à la fois la seule fin de lecture et des bibliothèques jumelé produites par la méthode T7LA sont très semblables les uns aux autres (figure 3C), qui permet aux chercheurs de comparer les données générées par les bibliothèques à partir de deux protocoles. Depuis ces bibliothèques ont été préparés à partir d&#39;embryons humains ARN des cellules souches, nous avons cherchépour les 30 gènes de cellules souches spécifiques entre les bibliothèques et constatent que la quasi-totalité de ces gènes (93-100%) sont identifiés par les bibliothèques fabriqués à partir d&#39;au moins 10 ng d&#39;ARN total de départ (figure 4), validant ainsi notre protocole. Nous croyons que notre protocole serait très utile pour les chercheurs, en particulier dans des circonstances telles que des cellules d&#39;écoulement triés ou laser micro-disséqués tissus où le matériel de départ est limitant. Dans de telles circonstances, notre protocole permettrait la génération de données d&#39;expression génique comparables aux bibliothèques fabriqués à partir de beaucoup plus grande quantité de départ, car notre protocole produit des profils d&#39;expression comparables à travers au moins 3 ordres de grandeur de l&#39;ARN de départ.

<table border="1"><tbody><tr><td> Société </td><td> Kit / Réactif </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires spéciales </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> La fragmentation de réactifs </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> L&#39;acrylamide Liner </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Megascript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC non traités eau sans nucléase </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP jeu </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP méthylés </td><td> R0431 </td><td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Génération kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cycles </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule. Peut être remplacé par l&#39;ONE échantillon d&#39;ADN de préparation Mix Master Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Génération kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Pour de préparation fin échantillon apparié ne </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Jumelés échantillon Fin Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Pour de préparation fin échantillon apparié ne </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb, plus l&#39;échelle </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Buffer brin deuxième 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Polymérase ADN de E. coli </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> SYBR E-gel sûre 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Exposant que jeII (avec 5X FS tampon et DTT 0,1 M) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ARN test quibit kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ADNdb HS qubit test kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli ADN ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ADN polymérase T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra pur Dnase Rnase l&#39;eau </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript II double brin kit de synthèse d&#39;ADNc </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Amorce aléatoire (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Pour de préparation fin échantillon apparié ne </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer amorce B </td><td> N / A </td><td> Pour lire Simple Samexemple de préparation ne </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> ONE </td><td> Not 1 kit de digestion </td><td> R0189S </td><td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Kit de purification de gel </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase jeu </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo recherche </td><td> L&#39;ADN propre et concentrateur (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Séquençage du transcriptome entier par l&#39;ARNm-Seq est maintenant largement utilisée pour effectuer l&#39;expression génique globale, la mutation, l&#39;allèle spécifique d&#39;expression et d&#39;autres analyses du génome entier. ARNm-Seq ouvre même la porte pour l&#39;analyse de l&#39;expression du gène de la non-séquencé les génomes. ARNm-Seq offre une sensibilité élevée, une large gamme dynamique et permet de mesurer le nombre de copies transcription dans un échantillon. Analyseur d&#39;Illumina génome effectue le séquençage d&#39;un grand nombre (&gt; 10 7) de la séquence relativement courte lit (&lt;150 pb). La «fin jumelé&quot; approche, dans laquelle une seule lecture longue est séquencé à ses deux extrémités, permet de suivre les jonctions d&#39;épissage alternatif , insertions et suppressions, et est utile pour l&#39;assemblage de novo du transcriptome. L&#39;un des défis majeurs auxquels sont confrontés les chercheurs est une quantité limitée de matériau de départ. Par exemple, dans des expériences où les cellules sont récoltées par laser de micro-dissection, disponible à partir d&#39;ARN totaux may mesure en nanogrammes. Préparation de l&#39;ARNm-Seq bibliothèques à partir de ces échantillons ont été décrites 1, 2, mais implique une quantité importante d&#39;amplification PCR qui peuvent introduire des biais. Autres ARN-Seq procédures de construction de bibliothèque avec un minimum d&#39;amplification PCR ont été publiés 3, 4, mais exigent des quantités microgramme de l&#39;ARN total de départ. Nous décrivons ici un protocole pour la plateforme Illumina Genome Analyzer II pour l&#39;ARNm-Seq séquençage pour la préparation de la bibliothèque qui évite significative l&#39;amplification par PCR et ne requiert que 10 nanogrammes d&#39;ARN total. Bien que ce protocole a été décrit précédemment et validés pour une seule fin de séquençage 5, où il a été montré pour produire des bibliothèques sans introduire de biais directionnel amplification significative, il est ici de valider encore pour être utilisé comme un protocole de fin appariées. Nous amplifier sélectivement les ARN messagers polyadénylé de commencer ARN total en utilisant la T7 basée Eberwine méthode d&#39;amplification linéaire, inventé &quot;T7LA &quot;(T7 linéaires d&#39;amplification). Le amplifié ARNm poly-A sont fragmentés, une transcription inverse et l&#39;adaptateur ligaturés pour produire la bibliothèque séquençage final. Pour les deux courses seule fin de lecture et appariés, les séquences sont mappés à l&#39;homme du transcriptome 6 et normalisée de sorte que les données de plusieurs exécutions peuvent être comparés. Nous rapportons la mesure d&#39;expression génique dans des unités de transcriptions par million (TPM), qui est une mesure supérieure à RPKM lorsque l&#39;on compare les échantillons 7.

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Nous décrivons ici une méthode pour la préparation des deux simples de lecture et jumelé fin Illumina ARNm-Seq bibliothèques de séquençage de l&#39;analyse d&#39;expression génique basée sur l&#39;ARN T7 linéaires d&#39;amplification. Ce protocole ne nécessite que 10 nanogrammes d&#39;ARN total de départ et génère des bibliothèques très cohérente représentant transcriptions ensemble.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d&#39;ARN total

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