Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממכון Morgridge למחקר באוניברסיטת ויסקונסין קרן. אנו מודים קריסטה איסטמן לסיוע העריכה.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

החוקרים לגלות כי ג&#39;ת הוא מייסד, stockowner, יועץ וחבר מועצת המנהלים של נייד Dynamics International (CDI). הוא גם משמש כיועץ מדעי ויש לו אינטרסים פיננסיים טקטיקות תא גזע ונצ&#39;רס II.

פרוטוקולים נוכחי להכנת ספריות סוף לזווג דורשים בין 1 מיקרוגרם 9-2.5 10 מיקרוגרם סכום התחלתי של RNA מוחלט. כאן אנו מציגים T7 מבוסס ליניארי שלנו הגברה (T7LA) שיטה להכין גם אחד לקרוא לזווג Illumina סוף ספריות רצף ולהראות כי שיטה זו מאפשרת לדור של ספריות מ ng נמוך כמו 10 של רנ&quot;א הכל, הפקת נתונים דומה לזה של הגברה מינימלית (MinAmp) ספריות עשוי מחומר 1000 החל לקפל יותר (10 מיקרוגרם RNA סה&quot;כ). 10 ספריות ng לא רק לזהות את המספרים הכוללים דומה של גנים, אלא גם לייצר חתימות התבטאות גנים דומים (איורים 3 א ו - ב). יתר על כן, גם ספריות יחיד סוף לקרוא לזווג המיוצר על ידי השיטה T7LA דומים מאוד זה לזה (איור 3c), אשר מאפשרת לחוקרים להשוות נתונים שנוצרו על ידי ספריות עשויות גם פרוטוקול. מכיוון שמדובר בספריות היו מוכנים מן האדם RNA לתא גזע עובריים, חיפשנועבור 30 גנים תא גזע מסוים בין הספריות למצוא שכמעט כל הגנים האלה (93-100%) מזוהים הספריות עשוי לפחות 10 ng להתחיל RNA הכולל (איור 4), ובכך אימות פרוטוקול שלנו. אנו מאמינים פרוטוקול שלנו יהיה מאוד שימושי עבור חוקרים, במיוחד בנסיבות כגון תאים זרימת מיון או לייזר מיקרו גזור רקמת שם חומר המוצא היא מגבילה. בנסיבות כאלה, פרוטוקול שלנו תאפשר הדור של נתונים ביטוי גנים דומים ספריות עשוי כמויות הרבה יותר גדול מאז החל פרוטוקול שלנו מייצרת פרופילי ביטוי דומה על פני לפחות 3 סדרי גודל של רנ&quot;א ההתחלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חברה </td><td> קיט / מגיב </td><td> קטלוג # </td><td> מיוחד תגובות </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> פיצול מגיב </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Acrylamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC ללא טיפול במים nuclease חינם </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP להגדיר </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> מפוגל dNTPs </td><td> R0431 </td><td> עבור הכנה יחיד מדגם לקריאה בלבד </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR אשכול הדור ערכת v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> עבור הכנה יחיד מדגם לקריאה בלבד </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq ערכת v5 36 מחזורים </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> שבב Seq מדגם Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> עבור הכנה יחיד מדגם קריאה בלבד. יכול להיות מוחלף עם חוד מערבבים DNA הכנה המדגם מאסטר סט 1 # חתול E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE אשכול הדור ערכת v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> עבור הכנה לזווג מדגם רק בסוף </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> מותאמים לדוגמא סוף Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> עבור הכנה לזווג מדגם רק בסוף </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb סולם בתוספת </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> גדיל חוצץ 2 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA פולימראז </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-ג&#39;ל SYBR% בטוח 2 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> כתב עילי אניהשני (עם 5X FS חיץ 0.1M DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit assay ערכת </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS קיוביט assay ערכת </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli האנזים DNA </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA פולימראז </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> אולטרה טהורים מים Dnase Rnase </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> כתב עילי כפול II תקועים ערכת סינתזה cDNA </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> פריימר אקראית (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> עבור הכנה לזווג מדגם רק בסוף </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer תחל ב </td><td> N / A </td><td> עבור יחיד קראו סםple הכנה בלבד </td></tr><tr><td> IDT </td><td> אוליגו DT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> חוד </td><td> Not1 העיכול ערכת </td><td> R0189S </td><td> עבור הכנה יחיד מדגם לקריאה בלבד </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute ערכת </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy מיני קיט (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> ג&#39;ל לטיהור ערכת </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase להגדיר </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute ערכת </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo מחקר </td><td> ה-DNA נקי concentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

רצף transcriptome שלמות על ידי Seq-mRNA משמש כיום באופן נרחב לבצע ביטוי גנים מוטציה העולמי, ספציפית אלל הביטוי ושאר הגנום כולו מנתח. mRNA-Seq אפילו פותח את השער לצורך ניתוח גנטי הביטוי של אי - רצף הגנום. mRNA-Seq מציע רגישות גבוהה, טווח דינמי גדול המאפשר מדידה של מספרים עותק תמליל במדגם. הגנום של Illumina מנתח מבצע רצף של מספר גדול (&gt; 10 7) של רצף קצר יחסית קורא (&lt;150 נ&quot;ב). &quot;לזווג סוף&quot; הגישה, לפיה לקרוא ארוך אחד הוא רצף בשני הקצוות שלה, מאפשרת מעקב בצמתים אחוי חלופי , הוספות ומחיקות, והוא שימושי להרכבה transcriptome דה נובו. אחד האתגרים העיקריים העומדים בפני החוקרים היא כמות מוגבלת של חומר המוצא. לדוגמה, בניסויים שבהם התאים נקצרים על ידי לייזר מיקרו לנתיחה, הכל זמין החל מ-RNAאיי למדוד ננוגרם. הכנת ה-mRNA-Seq ספריות דגימות כאלה תוארו 1, 2, אך כרוך הגברה משמעותית PCR שעשויים להציג את ההטיה. אחרים RNA-Seq הליכי הבנייה ספריה עם הגברה PCR מינימלי פורסמו 3, 4, אבל דורשים כמויות מיקרוגרם של החל RNA מוחלט. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור פלטפורמת הגנום Illumina השנייה Analyzer עבור סידור-mRNA Seq להכנת ספריה נמנע משמעותי הגברה PCR דורש רק 10 ננוגרם של רנ&quot;א הכל. אמנם זה פרוטוקול תוארה בעבר תוקף עבור יחיד סוף רצף 5, שם הוצגה לייצר ספריות כיוונית ללא החדרת הטיה הגברה משמעותית, הנה אנחנו לאמת אותו עוד יותר לשימוש בפרוטוקול סוף לזווג. אנחנו סלקטיבי להגביר RNAs שליח polyadenylated החל מ RNA סך באמצעות שיטה המבוססת T7 Eberwine הגברה ליניארית, שטבע &quot;T7LA &quot;(הגברה T7 ליניארי). מוגבר מרובה mRNAs הם מפוצלים, הפוכה יתוכתבו מתאם ligated לייצר ספריית רצף הסופי. עבור שתי ריצות יחיד סוף לקרוא יחד, רצפים ממופים transcriptome האנושי 6 ו מנורמל כך נתוני פועל מרובים ניתן להשוות. אנחנו הדו&quot;ח ביטוי גנים המדידה ביחידות של תמלילי למיליון (TPM), המהווה מדד מעולה RPKM כאשר משווים דגימות 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

כאן אנו מתארים שיטה להכנת שני יחיד לקרוא לזווג Illumina סוף mRNA-Seq ספריות לניתוח רצפי גנים הביטוי מבוסס על הגברה T7-RNA ליניארי. פרוטוקול זה דורש רק 10 ננוגרם של רנ&quot;א הכל החל ומייצר ספריות עקבי מאוד המייצגים תמלילי כולו.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...