Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
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यह काम अनुसंधान और विस्कॉन्सिन फाउंडेशन विश्वविद्यालय के लिए Morgridge संस्थान से धन के द्वारा समर्थित किया गया था. हम संपादकीय सहायता के लिए क्रिस्टा ईस्टमैन धन्यवाद.

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	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

लेखकों का खुलासा है कि जाट एक संस्थापक, stockowner, सलाहकार और सेलुलर गतिशीलता इंटरनेशनल (CDI) के बोर्ड के सदस्य है. उन्होंने यह भी के वैज्ञानिक सलाहकार के रूप में कार्य करता है और रणनीति द्वितीय स्टेम सेल वेंचर्स में वित्तीय हित है.

1 μg 9 से 2.5 μg 10 कुल शाही सेना के शुरू राशि के बीच बनती अंत पुस्तकालयों बनाने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. यहाँ हम हमारे रैखिक T7 प्रवर्धन आधारित (T7LA) विधि दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत Illumina अनुक्रमण पुस्तकालयों और दिखाने को तैयार है कि इस विधि की अनुमति देता है मौजूद कुल शाही सेना के रूप में कम के रूप में 10 एनजी से पुस्तकालयों, डेटा है कि के बराबर है उत्पादन की पीढ़ी न्यूनतम प्रवर्धित (MinAmp) 1000 गुना अधिक प्रारंभिक सामग्री (10 μg कुल शाही सेना) से बनाया पुस्तकालयों. 10 एनजी पुस्तकालयों इसी तरह जीन की कुल संख्या केवल पहचान नहीं है, लेकिन यह भी जीन की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर है कि समान हैं (आंकड़े 3a और ख) का उत्पादन. इसके अलावा, दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत पुस्तकालयों T7LA विधि द्वारा उत्पादित प्रत्येक (चित्र -3 सी) अन्य, जो शोधकर्ताओं या तो प्रोटोकॉल से बनाया पुस्तकालयों द्वारा उत्पन्न डेटा की तुलना करने के लिए अनुमति देता है बहुत समान हैं. चूंकि इन पुस्तकालयों मानव भ्रूण स्टेम सेल शाही सेना से तैयार थे, हम खोजापुस्तकालयों के बीच 30 स्टेम सेल विशिष्ट जीन के लिए और पाते हैं कि लगभग सभी इन जीनों के (93-100%) कुल शाही सेना (चित्रा 4) शुरू करने की कम से कम 10 एनजी से किए गए पुस्तकालयों द्वारा पहचाने जाते हैं, इस प्रकार हमारे प्रोटोकॉल मान्य. हम मानते हैं हमारे प्रोटोकॉल बहुत उपयोगी है, शोधकर्ताओं के लिए प्रवाह सॉर्ट किया गया कोशिकाओं या लेजर सूक्ष्म dissected ऊतक जहां सीमित है सामग्री शुरू करने के रूप में ऐसी परिस्थितियों में, विशेष रूप से होगा. ऐसी परिस्थितियों में, हमारे प्रोटोकॉल डाटा जीन की अभिव्यक्ति की पीढ़ी बहुत बड़ा शुरू मात्रा से बनाया के बाद से हमारे प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति शुरू शाही सेना के परिमाण के कम से कम 3 आदेश भर तुलनीय प्रोफाइल उत्पादन पुस्तकालयों के लिए तुलनीय की अनुमति होगी.

<table border="1"><tbody><tr><td> कंपनी </td><td> किट अभिकर्मक / </td><td> # सूचि </td><td> विशेष टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> विखंडन अभिकर्मक </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> लाइनर Acrylamide </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 किट </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> गैर DEPC nuclease मुफ्त पानी का इलाज </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP सेट </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> methylated dNTPs </td><td> R0431 </td><td> केवल एकल पढ़ें नमूना प्रस्तुत करने के लिए </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR क्लस्टर जनरेशन किट v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> केवल एकल पढ़ें नमूना प्रस्तुत करने के लिए </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq किट v5 36 चक्र </td><td> एफसी 104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> चिप Seq नमूना तैयारी किट </td><td> आईपी-102-1001 </td&gt; <td> एकल पढ़ें नमूना प्रस्तुत करने के लिए केवल. चोंच डीएनए नमूना प्रस्तुत करने का मास्टर मिक्स के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है एक बिल्ली # E6040S सेट </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq पीई क्लस्टर जनरेशन किट v5 </td><td> पीई-203-5001 </td><td> केवल बनती अंत नमूना प्रस्तुत करने के लिए </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> बनती अंत नमूना तैयारी किट </td><td> पीई-102-1001 </td><td> केवल बनती अंत नमूना प्रस्तुत करने के लिए </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb प्लस सीढ़ी </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ई. कोलाई RNase एच </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase आउट </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2 कतरा बफर 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ई जेल SYBR सुरक्षित% 2 </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> सुपरस्क्रिप्ट मैंद्वितीय (5X एफएस बफर और 0.1M डीटीटी के साथ) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> शाही सेना quibit परख किट </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA एचएस qubit परख किट </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ई. कोलाई डीएनए ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> अल्ट्रा शुद्ध DNase RNase पानी </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय फंसे सीडीएनए संश्लेषण किट डबल </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> रैंडम प्राइमर (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> केवल बनती अंत नमूना प्रस्तुत करने के लिए </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer बी प्राइमर </td><td> N / A </td><td> एकल पढ़ें सैम के लिएमिसाल प्रस्तुत करने का केवल </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> ठोंग </td><td> Not1 पाचन किट </td><td> R0189S </td><td> केवल एकल पढ़ें नमूना प्रस्तुत करने के लिए </td></tr><tr><td> क्विएज़न </td><td> Rneasy Minelute किट </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> क्विएज़न </td><td> RNEasy मिनी किट (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> क्विएज़न </td><td> जेल शुद्धि किट </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> क्विएज़न </td><td> DNase सेट </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> क्विएज़न </td><td> Rneasy MinElute किट </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo अनुसंधान </td><td> डीएनए स्वच्छ और concentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

यहाँ हम दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती जीन अभिव्यक्ति T7 रैखिक आरएनए प्रवर्धन पर आधारित विश्लेषण के लिए अंत Illumina mRNA Seq अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल कुल शाही सेना के शुरू के केवल 10 nanograms की आवश्यकता है और अत्यधिक अनुरूप पूरे टेप का प्रतिनिधित्व पुस्तकालयों उत्पन्न करता है.

एकल पढ़ें और बनती अंत mRNA Seq 10 कुल शाही सेना nanograms से Illumina पुस्तकालय

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

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