Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
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この作業は研究とウィスコンシン財団の大学Morgridge研究所からの資金によって支えられている。我々は編集支援のためクリスタイーストマンに感謝。

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	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

著者らは、JATが携帯電話ダイナミクス国際（CDI）の創設者、stockowner、コンサルタントおよびボードメンバーであることを開示している。彼はまたの科学顧問としての役割を果たし、タクティクスII幹細胞のベンチャーズの経済的利益を持っています。

ペアエンドライブラリを作るための現在のプロトコルは、1μgの9〜2.5μgのトータルRNAの10開始量の間に必要とする。ここでは、このメソッドは許可されている両方の単一の読み取りとペアエンドイルミナシーケンシングライブラリとショーを準備する私たちのリニアT7増幅系（T7LA）メソッドを提示するのに匹敵するデータを生成するトータルRNAのような低10 ngのからのライブラリの生成1000倍以上の出発原料（10μgのトータルRNA）から作られた最小限の増幅（MinAmp）ライブラリ。 10 ngのライブラリーは、遺伝子の類似の総数を特定するものではなく、また（図3aとb）類似している遺伝子発現の署名を生成しません。また、T7LA法により製造された単一の読み取りとペアエンドライブラリの両方は、研究者がどちらのプロトコルで作られたライブラリによって生成されたデータを比較できるようになる、（図3c）は互いに非常によく似ています。これらのライブラリは、ヒト胚性幹細胞のRNAから調製されて以来、我々が検索ライブラリのうち、30幹細胞特異的遺伝子のため、ほぼこれらの遺伝子のすべて（93から100パーセント）はこのように我々のプロトコルを検証する、トータルRNAを（図4）出発の少なくとも10 ngのから作られたライブラリによって識別されていることがわかります。我々は、我々のプロトコルは、特にそのようなフローソートされた細胞または出発物質が制限され、レーザーマイクロ解剖組織としての状況では、研究者にとって非常に有用ではないかと思います。このような状況では、我々のプロトコルは、我々のプロトコルが開始RNAの大きさの少なくとも3桁でほぼ同等の発現プロファイルを生成するので、はるかに大きいの開始量から作られたライブラリに匹敵する遺伝子発現データの生成をできるようになります。

<table border="1"><tbody><tr><td>会社</td><td>キット/試薬</td><td>カタログ＃ </td><td>特別なコメント</td></tr><tr><td>アンビオン</td><td>断片化試薬</td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオン</td><td>ライナーのアクリルアミド</td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオン</td><td> MEGAscript T7キット</td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオン</td><td>非DEPCは、ヌクレアーゼフリーの水を扱わ</td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTPのセット</td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td>メチル化のdNTP </td><td> R0431 </td><td>唯一のシングルリードのサンプル調製用</td></tr><tr><td>イルミナ</td><td> TruSeq SRクラスタ生成キットV5 </td><td> GD - 203 - 5001 </td><td>唯一のシングルリードのサンプル調製用</td></tr><tr><td>イルミナ</td><td> TruSeqのSeqキットV5 36サイクル</td><td> FC - 104 - 5001 </td><td></td></tr><tr><td>イルミナ</td><td>チップのSeqサンプル調製キット</td><td> IP - 102 - 1001 </td&gt; <td>シングルリードサンプル調製用のみ。 1 CAT＃E6040S設定NEB DNAサンプルプレップマスターミックスに置き換えることができます。 </td></tr><tr><td>イルミナ</td><td> TruSeq PEクラスタ生成キットV5 </td><td> PE - 203 - 5001 </td><td>ペアエンドサンプル調製用のみ</td></tr><tr><td>イルミナ</td><td>ペアエンドサンプル前処理キッ​​ト</td><td> PE - 102 - 1001 </td><td>ペアエンドサンプル調製用のみ</td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> 1キロバイトプラスはしご</td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>大腸菌のRNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> RNaseのアウト</td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>第二鎖バッファー5倍</td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>大腸菌のDNAポリメラーゼ</td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> E -ゲルSYBR安全な2パーセント</td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>上付きIII（5X FSバッファおよび0.1M DTT付き） </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>トリゾール</td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> RNA quibitアッセイキット</td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> dsDNAをHS量子ビットアッセイキット</td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>大腸菌DNAリガーゼ</td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td> T4 DNAポリメラーゼ</td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>超高純度のDNase RNaseの水</td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>スーパースクリプトII二本鎖cDNA合成キット</td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td>インビトロジェン</td><td>ランダムプライマー（Invitrogen社） </td><td> 48190-011 </td><td>ペアエンドサンプル調製用のみ</td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer Bのプライマー</td><td> N / </td><td>シングルリードSAM用PLE準備のみ</td></tr><tr><td> IDT </td><td>オリゴdT T7 </td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> NOT1消化キット</td><td> R0189S </td><td>唯一のシングルリードのサンプル調製用</td></tr><tr><td>キアゲン</td><td>をRNeasyアプライキット</td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td> RNeasyミニキット（50） </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td>ゲル精製キット</td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td> DNase処理セット</td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td>キアゲン</td><td>したRNeasyアプライキット</td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo研究</td><td> DNAクリーンとコンセントレータ（250X） </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

mRNAのseqで全トランスクリプトームの配列決定は、現在、グローバルな遺伝子発現、突然変異、対立遺伝子特異的発現および他のゲノムワイドな解析を実行するために広く使用されている。 mRNAのSeqはさらに、非塩基配列ゲノムの遺伝子発現解析のためのゲートを開きます。 mRNAのSeqは高感度、広いダイナミックレンジを提供し、サンプル中の転写産物のコピー数を測定することができます。イルミナ社のGenome Analyzerは、単一の長いリードを特徴とする&quot;ペアエンド&quot;のアプローチは、両方の両端に配列決定されている。大比較的短いシーケンスの数（&gt; 10 7）（&lt;150 bp）の読み取りの配列決定を行い、選択的スプライシングのジャンクションを追跡することができます、挿 ​​入や削除、およびde novoのトランスクリプトームアセンブリするのに便利です。 研究者が直面する大きな課題の一つは、出発原料の限られた量です。トータルRNA mを開始例えば、細胞がレーザーマイクロダイセクションで採取される実験では、利用可能なナノグラムの措置をAYがつきます。このようなサンプルからのmRNA - seqのライブラリーの調製は、1、2を説明するが、バイアスを導入することが重要なPCR増幅を伴うしている。最小限のPCR増幅を持つ他のRNA - seqのライブラリー構築の手順は3、4を発表したが、全体のRNAを開始するのマイクログラムの量を必要とされている。 ここでは重要なPCR増幅を回避し、トータルRNAのわずか10ナノグラムを必要とするライブラリの準備のためのmRNA - seqのシーケンスのためのイルミナGenome AnalyzerのIIのプラットフォーム用のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、それが重要な増幅バイアスを導入せず、方向ライブラリーを作製することが示されたシングルエンドシーケンシング5、の説明で述べたと検証してきたが、ここでは、ペアエンドのプロトコルとして使用するためにさらにそれを検証する。我々は選択的に&quot;T7造語、T7ベースのEberwineリニア増幅法を用いてトータルRNAを起動ポリアデニルメッセンジャーRNAを増幅LA&quot;（T7リニア増幅）。mRNAの断片化されて増幅されたポリ、最終的なシーケンスのライブラリを生成するライゲーション転写し、アダプタを逆にする。双方単一の読み取りとペアエンドの実行では、配列がヒトのトランスクリプトーム6にマップされているとなるように正規化複数の実行からのデータを比較することができます。我々は試料7を比較するときRPKMに優れた尺度である百万ごとの転写産物の単位で遺伝子発現の測定（TPM）を、報告する。

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

ここでは、T7リニアRNA増幅に基づく遺伝子発現解析用のライブラリーのシークエンシングの両方シングルリードとペアエンドイルミナのmRNA - seqの製造方法を説明します。このプロトコルは、トータルRNAを始めるのは10ナノグラムを必要とし、全体の転写産物を表す非常に一貫性のあるライブラリを生成します。

10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ

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Research

JoVE Journal

Biology

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