Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Morgridge Institute for Research og University of Wisconsin Foundation. Vi takker Krista Eastman for redaksjonell bistand.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Forfatterne avslører at JAT er en gründer, stockowner, konsulent og styremedlem i Cellular Dynamics International (CDI). Han er også vitenskapelig rådgiver til og har økonomiske interesser i Tactics II Stem Cell Ventures.

Gjeldende protokoller for å gjøre sammen end biblioteker krever mellom 1 mikrogram 9 til 2,5 mikrogram 10 begynner mengden av total RNA. Her presenterer vi våre lineær T7 forsterkning basert (T7LA)-metoden for å forberede både enkelt lese og koblet slutten Illumina sekvensering biblioteker og viser at denne metoden gjør generasjonen av biblioteker fra så lite som 10 ng total RNA, produsere data som er sammenlignbar med minimalt forsterket (MinAmp) biblioteker laget fra 1000 ganger mer utgangsmaterialet (10 mikrogram total RNA). De 10 ng bibliotekene ikke bare identifisere lik totalt antall gener, men også produsere genekspresjonssignaturer som ligner (figur 3a og b). Dessuten både enkelt lese og koblet end biblioteker produsert av T7LA metoden er svært like hverandre (figur 3c), som tillater forskerne å sammenligne data generert av biblioteker laget fra enten protokollen. Siden disse bibliotekene var forberedt fra humane embryonale stamceller RNA, søkte vifor 30 stamcelleforskningen spesifikke gener blant bibliotekene og finner ut at nesten alle av disse genene (93-100%) er identifisert av biblioteker laget av minst 10 ng start total RNA (figur 4), og dermed validere vår protokoll. Vi tror at vår protokoll ville være svært nyttig for forskere, særlig i forhold som flyt sorteres celler eller laser-micro-dissekert vev hvor utgangsmaterialet er begrensende. Under slike omstendigheter, ville vår protokoll tillate generasjon av genuttrykk data sammenlignes med biblioteker laget fra mye større start mengder siden vår protokoll produserer uttrykk profiler sammenlignbare på tvers av minst 3 størrelsesordener av å starte RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Firma </td><td> Kit / Reagens </td><td> Catalog # </td><td> Spesielle kommentarer </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentering reagens </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Akrylamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Non DEPC behandlet nukleasefritt fritt vann </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP satt </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> denaturert dNTPs </td><td> R0431 </td><td> For Enkelt Les prøve prep kun </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> For Enkelt Les prøve prep kun </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 sykluser </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> For Enkelt Les prøve prep bare. Kan erstattes med NEB DNA-prøve prep Master Mix Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> For paret end prøve prep kun </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Sammenkoblede Slutt Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> For paret end prøve prep kun </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB pluss stige </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Andre strand buffer 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polymerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR trygt 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Hevet jegII (med 5x FS buffer og 0.1m DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit analysen kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit assay kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA Polymerase </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure DNase RNase vann </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Hevet II dobbel strandet cDNA syntese kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Tilfeldige Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> For paret end prøve prep kun </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B primer </td><td> N / A </td><td> For Enkelt Les sample prep bare </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 fordøyelsen kit </td><td> R0189S </td><td> For Enkelt Les prøve prep kun </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel rensing kit </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase satt </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Forskning </td><td> DNA ren og konsentratoren (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Whole transkriptom sekvensering av mRNA-Seq brukes nå i stor utstrekning til å utføre global genekspresjon, mutasjon, allel-spesifikke uttrykk og andre genom-wide analyser. mRNA-Seq åpner selv porten for genekspresjonsanalyse av ikke-sekvensert genomene. mRNA-Seq gir høy følsomhet, et stort dynamisk område og muliggjør måling av vitnemål kopiere numre i en prøve. Illumina genom analysator utfører sekvensering av et stort antall (&gt; 10 7) av relativt kort sekvens leser (&lt;150 bp). Den &quot;paret end&quot; tilnærming, hvor en enkelt lang lest er sekvensert i begge endene, gir mulighet for sporing alternative spleise veikryss , innsettinger og slettinger, og er nyttig for de novo transkriptom montering. En av de store utfordringene forskerne er en begrenset mengde av utgangsmaterialet. For eksempel i eksperimenter der cellene er høstet av laser mikro-disseksjon, tilgjengelig fra total RNA may tiltaket i nanogram. Utarbeidelse av mRNA-Seq biblioteker fra slike prøver har blitt beskrevet 1, 2, men innebærer betydelige PCR forsterkning som kan introdusere bias. Andre RNA-Seq bibliotek konstruksjon prosedyrer med minimal PCR forsterkning har blitt publisert 3, 4 men krever mikrogram mengder start total RNA. Her beskriver vi en protokoll for Illumina Genome Analyzer II plattform for mRNA-Seq sekvensering for bibliotek forberedelse som unngår betydelige PCR forsterkning og krever bare 10 nanogram av total RNA. Mens denne protokollen har blitt beskrevet tidligere, og validert for single-end 5 sekvensering, der den ble vist å produsere retningsbestemt biblioteker uten å innføre betydelig forsterkning bias, her vi validere den videre til bruk som en sammenkoblet end protokoll. Vi selektivt forsterke polyadenylated messenger RNA fra start total RNA bruker T7 basert Eberwine lineær forsterkning metode, laget &quot;T7LA &quot;(T7 lineær forsterkning). Den forsterkede poly-A mRNAs er fragmentert, revers transkribert og adapter ligated å gi det endelige sekvensering biblioteket. For både single lese og koblet slutt kjører, sekvenser tilordnet den menneskelige transkriptom 6 og normalisert slik at data fra flere løper kan sammenlignes. Vi rapporterer de genuttrykk måling i enheter på utskrifter per million (TPM), som er et overordnet mål å RPKM når man sammenligner prøvene 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Her beskriver vi en metode for utarbeidelse av både single lese og koblet end Illumina mRNA-Seq sekvensering biblioteker for genekspresjonsanalyse basert på T7 lineære RNA forsterkning. Denne protokollen krever bare 10 nanogram av å starte total RNA og genererer svært konsistente bibliotekene representerer hele transkripsjoner.

Enkelt Les og Sammenkoblede Slutt mRNA-Seq Illumina Bibliotekene fra 10 nanogram Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transkripsjon og tildekking av Gaussia luciferase mRNA Etterfulgt av Jakten Cell Transfeksjon

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analyse av RNA prosessering reaksjoner Bruke Cell Free Systems: 3 &#39;End spalting av Pre-mRNA Underlag<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cellen spesifikk Epigenome profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kjerneisolasjon fra voksen musnyre for RNA-sekvensering med en kjerne

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering og transkriptomanalyse av plantecelletyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...