Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
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Este trabalho foi financiado por fundos do Instituto Morgridge de Pesquisas e da Universidade de Wisconsin Foundation. Agradecemos a Krista Eastman para a assistência editorial.

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	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Os autores revelam que JAT é um dos fundadores, stockowner, consultor e membro do conselho da Cellular Dynamics International (CDI). Ele também atua como assessor científico e tem interesses financeiros em Tactics II Ventures células-tronco.

Protocolos atuais para fazer bibliotecas final emparelhados exigem entre 1 mg 9-2,5 mg 10 montante inicial de RNA total. Aqui apresentamos a nossa linear de amplificação T7 método (T7LA) com base para preparar a única bibliotecas final ler e emparelhado Illumina seqüenciamento e mostrar que este método permite a geração de bibliotecas de tão baixo quanto 10 ng de RNA total, produzindo dados que é comparável à de minimamente amplificado (MinAmp) bibliotecas feitas a partir de 1000 o material de partida vezes mais (10 mg RNA total). As 10 bibliotecas ng não só identificar semelhante o número total de genes, mas também produzem assinaturas de expressão gênica que são semelhantes (Figuras 3a e b). Além disso, tanto o single bibliotecas final ler e pares produzidas pelo método T7LA são muito semelhantes entre si (Figura 3c), que permite aos pesquisadores comparar os dados gerados pelas bibliotecas feitas a partir de qualquer protocolo. Uma vez que essas bibliotecas foram preparados a partir de RNA humano de células-tronco embrionárias, buscamosde 30 genes de células-tronco específicas entre as bibliotecas e descobrir que quase todos esses genes (93-100%) são identificadas pelas bibliotecas feita a partir de pelo menos 10 ng de RNA total de partida (Figura 4), validando o nosso protocolo. Acreditamos que o nosso protocolo seria muito útil para pesquisadores, especialmente em circunstâncias como as células de fluxo classificados ou a laser micro-dissecados tecidos onde o material de partida é limitante. Em tais circunstâncias, o nosso protocolo permitiria a geração de dados de expressão gênica comparável às bibliotecas feita a partir de quantidades muito maiores de partida desde o nosso protocolo produz perfis de expressão comparáveis ​​entre pelo menos 3 ordens de magnitude de RNA de partida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Companhia </td><td> Kit / Reagente </td><td> Catalogo </td><td> Comentários especiais </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> O reagente de fragmentação </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> A acrilamida Liner </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC não tratados água livre de nuclease </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTPs metilado </td><td> R0431 </td><td> Para preparação de amostras Único Somente leitura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Para preparação de amostras Único Somente leitura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 ciclos </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Amostra Seq Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Para preparação de amostras Único Somente leitura. Pode ser substituído por amostra NEB prep DNA Mix Master Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Para prep emparelhado final amostra apenas </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Emparelhado End Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Para prep emparelhado final amostra apenas </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb ladder mais </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Tampão vertente 2 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR 2% seguro </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Sobrescrito III (com 5X FS buffer e DTT 0,1 M) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA ensaio quibit kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit ensaio kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Polimerase DNA T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure Dnase água Rnase </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Sobrescrito II dupla kit síntese de cDNA encalhado </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Primer aleatório (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Para prep emparelhado final amostra apenas </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer cartilha B </td><td> N / A </td><td> Para Single Leia samsoas prep apenas </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 kit digestão </td><td> R0189S </td><td> Para preparação de amostras Único Somente leitura </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Kit de purificação de gel </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Research </td><td> DNA limpo e concentrador (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Seqüenciamento do transcriptoma inteiro por mRNA Seq-se amplamente utilizado para realizar a expressão gênica global, mutação, expressão alelo-específico e outras análises genômicas. mRNA-Seq ainda abre o portão para a análise de expressão gênica de genomas seqüenciados não. mRNA Seq oferece alta sensibilidade, uma grande gama dinâmica e permite a medição do número de cópias transcrição em uma amostra. Analisador Illumina genoma realiza sequenciamento de um grande número (&gt; 10 7) da seqüência relativamente curta lê (&lt;150 pb). O &quot;emparelhado fim&quot; abordagem, em que uma leitura única e longa é seqüenciado em ambas as extremidades a sua, permite o rastreamento junções splice alternativo , inserções e deleções, e é útil para a montagem de transcriptoma novo. Um dos grandes desafios enfrentados pelos pesquisadores é uma quantidade limitada de matéria-prima. Por exemplo, em experimentos onde as células são colhidas por laser micro-dissecção, disponível a partir de RNA total de may medida em nanogramas. Preparação de mRNA Seq-bibliotecas a partir de tais amostras foram descritas 1, 2, mas envolve a amplificação por PCR significativo que pode introduzir viés. Outros RNA-Seq procedimentos de construção da biblioteca com a amplificação PCR mínima foram publicados 3, 4, mas requerem quantidades micrograma de RNA total de partida. Aqui nós descrevemos um protocolo para a plataforma Illumina Genome Analyzer II para mRNA Seq-seqüenciamento para a preparação de biblioteca que evita a amplificação PCR significativa e requer apenas 10 nanogramas de RNA total. Embora este protocolo foi descrito anteriormente e validado para um único fim de seqüenciamento 5, onde foi mostrado para produzir bibliotecas direcional sem introduzir viés de amplificação significativa, aqui nós validá-lo para utilização como um protocolo final emparelhados. Nós seletivamente amplificam RNA mensageiro polyadenylated de iniciar RNA total usando o T7 com base Eberwine método de amplificação linear, cunhado &quot;T7LA &quot;(T7 amplificação linear). Amplificada O poli-A mRNAs são fragmentados, reverso transcrito e adaptador ligado para produzir a biblioteca seqüenciamento final. Para ambos única corre final ler e emparelhado, as seqüências são mapeados para o transcriptoma humano 6 e normalizados para que dados de várias execuções podem ser comparados. Relatamos a medida de expressão gênica em unidades de transcrições por milhão (TPM), que é uma medida superior a RPKM quando se comparam amostras 7.

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Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Aqui nós descrevemos um método para a preparação de ambos única leitura e emparelhado final Illumina mRNA Seq-libraries seqüenciamento para análise de expressão gênica com base na amplificação T7 RNA linear. Este protocolo requer apenas 10 nanogramas de começar RNA total e gera bibliotecas altamente consistentes representando transcrições todo.

Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

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