Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансирование из Моргридж Института исследований и Университета Висконсин Foundation. Мы благодарим Криста Eastman за помощь в редактировании.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Авторы раскрывают, что JAT является учредителем, акционерному, консультантом и членом правления Сотовая Динамика International (CDI). Он также выступает в качестве научного советника и имеет финансовые интересы в тактике Ventures II стволовых клеток.

Действующие протоколы для изготовления парных библиотеки конца требует от 1 до 9 мкг до 2,5 мкг 10, начиная от общего количество РНК. Здесь мы представляем наш линейного усиления T7 основе (T7LA) для подготовки как одиночного, так и парные читать конца Illumina секвенирование библиотек и показать, что этот метод позволяет получать библиотек на уровне 10 нг общей РНК, производя данных, сравнимую с минимально усиливается (MinAmp) библиотеки из 1000 раз больше исходного материала (10 мкг общей РНК). 10 нг библиотеки не только выявить подобный общее число генов, но также производят экспрессии генов подписи, которые подобны (рис. 3а, б). Более того, и одно чтение и парных конце библиотек, полученных методом T7LA очень похожи друг на друга (рис. 3в), что позволяет исследователям сравнить данные, полученные из библиотеки либо протокол. Поскольку эти библиотеки были изготовлены из человеческих эмбриональных стволовых клеток, РНК, мы искалив течение 30 стволовых клеток, специфических генов среди библиотек и обнаружили, что почти все эти гены (93-100%) идентифицируются библиотек из не менее 10 нг начала тотальной РНК (рис. 4), таким образом, проверка нашего протокола. Мы считаем, что наш протокол будет очень полезной для исследователей, особенно в обстоятельствах, таких как поток отсортированных клеток или лазерной микро-расчлененный ткани, где исходным материалом является предельным. В таких условиях наш протокол позволит поколение данных генной экспрессии сопоставимо с библиотеками из гораздо большего количества, начиная со времени нашего протокола производит профили экспрессии сопоставимы по крайней мере, 3 порядков, начиная РНК.

<table border="1"><tbody><tr><td> Компания </td><td> Kit / Реагенты </td><td> Каталог # </td><td> Специальные Комментарии </td></tr><tr><td> Амбион </td><td> Фрагментация реагента </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Амбион </td><td> Liner Акриламид </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Амбион </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Амбион </td><td> Номера DEPC лечение нуклеазы свободной воды </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> дНТФ набор </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> метилированные дНТФ </td><td> R0431 </td><td> Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR генерации кластеров комплект v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 циклов </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Чип Пример Seq Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только. Может быть заменен NEB образец ДНК Mix приготовительный Мастер Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE генерации кластеров комплект v5 </td><td> ПЭ-203-5001 </td><td> Для парных приготовительный образца конца только </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Парные Конец примера Prep Kit </td><td> ПЭ-102-1001 </td><td> Для парных приготовительный образца конца только </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1 КБ плюс лестница </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Кишечная палочка РНКазы Н </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> РНКазы Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Второй буфер прядь 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Кишечная палочка ДНК-полимеразы </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-гель SYBR безопасной 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Надстрочный яII (с 5-кратным FS буфера и 0,1 М ДТТ) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> РНК quibit анализа комплект </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> дц HS кубит анализа комплект </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Кишечная палочка ДНК-лигазы </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 ДНК-полимеразы </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure ДНКазы РНКазы воды </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Надстрочный II двухцепочечной кДНК комплект синтеза </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Случайные Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Для парных приготовительный образца конца только </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B грунтовки </td><td> N / A </td><td> Для Одноместный Прочитано образцовНапример приготовительный только </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo дТ T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 пищеварения комплект </td><td> R0189S </td><td> Для Одноместный Прочитано образец приготовительный только </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute комплект </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Комплект Гель очистки </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> ДНКазы набор </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute комплект </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo исследований </td><td> ДНК чистой и концентратора (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Всего секвенирования транскриптома по мРНК-Seq в настоящее время широко используется для выполнения глобальной экспрессии генов, мутации, аллель-специфическая экспрессия и других генома анализа. мРНК-Seq даже открывает ворота для анализа экспрессии генов не-последовательности геномов. мРНК-Seq обеспечивает высокую чувствительность, широкий динамический диапазон измерений и позволяет чисел стенограмму копию в образце. Генома анализатор Illumina это выполняет последовательность большого числа (&gt; 10 7) относительно короткие последовательности операций чтения (&lt;150 б.п.). &quot;Парные конца&quot; подход, при котором один длинный прочитанных последовательно на обоих концах, позволяет для отслеживания альтернативные переходы сращивания , вставки и удаления, и полезно для де сборку заново транскриптома. Одной из главных задач, стоящих перед исследователями, является ограниченное количество исходного материала. Например, в экспериментах, где клетки собирают лазерной микро-диссекции, доступны с полной РНК май меры в нанограмм. Подготовка мРНК-Seq библиотеки из таких образцов были описаны 1, 2, но требует значительных ПЦР, которая может вносить систематическую ошибку. Другие РНК-Seq библиотеки строительства процедур с минимальным ПЦР были опубликованы 3, 4, но требуют мкг количества начальный суммарный вес РНК. Здесь мы опишем протокол для Illumina Genome Analyzer II платформу для мРНК-Seq последовательности для подготовки библиотеки, что позволяет избежать значительных ПЦР-амплификации и требует всего 10 нанограмм от общего числа РНК. Хотя этот протокол был описан ранее и проверены одного конца последовательности 5, где было показано, для получения направленного библиотек, не внося значительный уклон усиления, то здесь мы проверить его в дальнейшем для использования в качестве парного конце протокола. Мы избирательно усиливать полиаденилированной РНК посланник начальный суммарный вес РНК с использованием T7 основан Eberwine линейный метод амплификации, придумал &quot;Т7LA &quot;(T7 линейного усиления). Усиливается поли-мРНК фрагментированы, обратной транскрипции и адаптер лигировали для получения окончательного библиотеки последовательности. Для обоих одно чтение и парных работает конца, последовательности отображаются на человека транскриптома 6 и нормированы так, что данные из нескольких работает, можно сравнить. Мы сообщаем измерения экспрессии генов в единицах стенограммы на миллион (TPM), который является превосходной мерой RPKM при сравнении образцов 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Здесь мы опишем способ получения как одиночных и парных читать конца Illumina мРНК-Seq секвенирование библиотеки для экспрессии генов анализ, основанный на T7 усиления линейной РНК. Этот протокол предполагает только 10 нанограмм начала тотальной РНК и генерирует очень последовательным библиотек, представляющим весь транскриптов.

Одноместный Читайте и парные Конец мРНК-Seq Illumina библиотек из 10 нанограмм Всего РНК

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

РНК Извлечение из Neuroprecursor ячеек с использованием Bio-Rad Всего РНК Kit

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

В пробирке транскрипции и укупорки мРНК люциферазы Gaussia Вслед за Трансфекция Сотовые HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Анализ РНК обработки реакций с помощью мобильного Бесплатные системы: 3 &#39;Конец расщепление пре-мРНК подложках<em&gt; В пробирке</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Выделение ядер из почек взрослой мыши для секвенирования одноядерной РНК

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Выделение и транскриптомный анализ типов растительных клеток

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...