Name: single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Detta arbete stöddes av medel från Morgridge institutet för forskning och University of Wisconsin-stiftelsen. Vi tackar Krista Eastman för redaktionell hjälp.

<ol>
	<li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li><li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis.">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRT-seq+amplification-free,+strand-specific+transcriptome+sequencing.">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li><li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+consistent,+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA.">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li><li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty.">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li></ol>

Författarna avslöja att JAT är en av grundarna, stockowner, konsult och styrelseledamot i Cellular Dynamics International (CDI). Han är även vetenskaplig rådgivare till och har ekonomiska intressen i Taktik II Ventures stamceller.

Nuvarande protokoll för att göra parade slutet bibliotek kräver mellan 1 mikrogram 9 till 2,5 mikrogram 10 grundbelopp av det totala RNA. Här presenterar vi våra linjär T7 förstärkning baserade (T7LA) metod för att förbereda både singel läsa och parade slutet Illumina sekvensering bibliotek och visa att denna metod gör det möjligt generation av biblioteken från så lågt som 10 ng av det totala RNA, som producerar data som är jämförbar med minimalt Amplified (MinAmp) bibliotek gjord 1000 gånger mer utgångsmaterial (10 mikrogram total RNA). Den 10 ng biblioteken inte bara identifiera liknande totala antalet gener, utan också producera signaturer genuttryck som liknar (figur 3a och b). Dessutom både enskilt läsa och parade slutet bibliotek som produceras av T7LA metoden är mycket lika varandra (figur 3c), som ger forskare möjlighet att jämföra data som genereras av biblioteken tillverkas antingen protokollet. Eftersom dessa bibliotek var beredda från mänskliga embryonala RNA stamceller, sökte viför 30 stamceller specifika gener hos bibliotek och finner att nästan alla av dessa gener (93-100%) identifierats genom biblioteken skall till minst 10 ng start totala RNA (Figur 4) och på så sätt validera våra protokoll. Vi tror att vårt protokoll skulle vara mycket användbart för forskare, särskilt under sådana omständigheter som flöde sorteras celler eller laser-mikro-dissekerat vävnaden där utgångsmaterialet är begränsande. Under sådana omständigheter skulle våra protokoll kan ta fram uppgifter genuttryck jämförbar med bibliotek gjorda av mycket större starta mängder eftersom våra protokoll ger uttryck profiler jämförbara mellan minst tre tiopotenser att starta RNA.

<table border="1"><tbody><tr><td> Företag </td><td> Kit / reagens </td><td> Catalog # </td><td> Speciella kommentarer </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Fragmentering reagens </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Liner Akrylamid </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Icke DEPC behandlas nukleas fritt vatten </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP som </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> metyleras dNTPs </td><td> R0431 </td><td> För Single Läs prov prep bara </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> För Single Läs prov prep bara </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cykler </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> För Single Läs prov prep bara. Kan ersättas med de nationella tillsynsorganen DNA-prov prep Master Mix Ställ en katt # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> För parade slutet prov prep bara </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Paired End Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> För parade slutet prov prep bara </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1KB plus stege </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNas H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNas Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 2:a strand buffert 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-polymeras </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR säker 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Upphöjd jagII (med 5X FS buffert och 0,1 miljoner DTT) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA quibit assay kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit test kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA-ligas </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> T4 DNA-polymeras </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultrarent DNas RNas vatten </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Upphöjd II dubbelsträngad cDNA syntes kit </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Slumpmässiga Primer (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> För parade slutet prov prep bara </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer B primer </td><td> N / A </td><td> För Singel Läs SamPLE prep bara </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 matsmältningen kit </td><td> R0189S </td><td> För Single Läs prov prep bara </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kit </td><td> 74.204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74.104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Gel rening kit </td><td> 28.604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNas in </td><td> 79.254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74.204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Forskning </td><td> DNA-ren och koncentrator (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

single read and paired end mrna-seq illumina libraries from 10 nanograms total rna

Hela transkriptom sekvensering av mRNA-Seq nu används i stor utsträckning för att utföra globala genuttryck, mutation, allel-specifika uttryck och andra heltäckande genomanalyser. mRNA-Seq öppnar även grinden för genuttryck analys av icke-sekvenserat genomet. mRNA-Seq erbjuder hög känslighet, ett stort dynamiskt omfång och möjliggör mätning av antalet avskrift kopia i ett prov. Illumina arvsmassa analysator utför sekvensering av ett stort antal (&gt; 10 7) av relativt kort sekvens läser (&lt;150 BP). Den &quot;parade slut&quot;-metoden, där en enda lång läsa är sekvenserat både dess ändar, möjliggör spårning alternativa skarv korsningar , infogningar och borttagningar och är användbar för de novo transkriptom montering. En av de stora utmaningarna för forskarna är en begränsad mängd utgångsmaterial. Till exempel i experiment där cellerna skördas med laser micro-dissektion, tillgänglig från total RNA may åtgärd i nanogram. Beredning av mRNA-Seq bibliotek från sådana prover har beskrivits ett, två men innebär betydande PCR-amplifiering som kan sprida fördomar. Andra RNA-Seq bibliotek konstruktion förfaranden med minimal PCR-amplifiering har publicerats 3, 4 men kräver mikrogram mängder av start totala RNA. Här beskriver vi ett protokoll för Illumina Genome Analyzer II plattform för mRNA-Seq sekvensering för biblioteks-beredningen som undviker betydande PCR-amplifiering och kräver endast 10 nanogram av det totala RNA. Även om detta protokoll har beskrivits tidigare och validerats för ensamstående slut sekvensering 5, där det visades att producera riktad bibliotek utan att införa betydande förstärkning bias, här är vi validera den ytterligare för att användas som ett parade slut protokoll. Vi förstärker selektivt polyadenylated budbärar-RNA från att starta totala RNA med T7 baserat Eberwine linjär förstärkning metod, myntade &quot;T7LA &quot;(T7 linjär förstärkning). Det förstärkta poly-A mRNA är fragmenterade, omvänd transkriberas och adapter knyts ihop och ger de slutliga sekvensering biblioteket. För både singel läsa och parade slutet körs, är sekvenser mappas till den mänskliga transkriptom 6 och normaliserade så att data från flera körningar kan jämföras. Vi rapporterar mätningen genuttryck i enheter av avskrifter per miljon (TPM), vilket är en överlägsen åtgärd för att RPKM när man jämför prover 7.

Watch this Scientific Journal Video about Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA at JoVE.com

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Här beskriver vi en metod för framställning av både enskilda läsa och parade mRNA-Seq slutet Illumina sekvensering bibliotek för genuttryck analys baserad på T7 linjär RNA förstärkning. Detta protokoll kräver endast 10 nanogram att starta totala RNA och genererar mycket konsekvent bibliotek som representerar hela avskrifter.

Enstaka Läs och Paired End-mRNA-Seq Illumina bibliotek från 10 nanogram Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

RNA-extraktion från Neuroprecursor celler med Bio-Rad Totalt RNA Kit

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

En hög genomströmning skärm för Biomining cellulas aktivitet från Metagenomic bibliotek

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkription och begränsning av Gaussia Luciferas mRNA Följt av HeLa celltransfektion

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Kromatin Interaktion Analys med parade-End Tag sekvensering (CHIA-PET) för kartläggning kromatin Interaktioner och förstå transkriptionsreglering

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Analys av RNA Processing Reaktioner Använda Cell Free Systems: 3 &#39;End Cleavage av Pre-mRNA-substrat<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Cell-typspecifika epigenomet profilering

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

Kärnisolering från vuxen musnjure för RNA-sekvensering med en kärna

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering och transkriptomanalys av växtcelltyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...