Name: patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Wij danken dr. Fred Rieke voor zijn vriendelijke uitleg van de agar-embedded netvlies slice voorbereiding toen we begonnen met het protocol in ons lab. We danken ook Lori Vaskalis voor de illustratie van schematisch overzicht en Drs. Veeramuthu Balakrishnan en Soyoun Cho voor nuttige commentaar op de tekst en video. Dit werk werd ondersteund door een NEI-NIH RO1 te verlenen, en was ook gedeeltelijk ondersteund door een Korea Research Foundation Grant gefinancierd door de Koreaanse regering [KRF-2008-357-E00032].

1. Externe en interne oplossingen <ol><li> Bereid snijden oplossing (laag calcium) uit 10x stockoplossing en voeg MgCl 2, CaCl 2, en D-glucose dagelijks. De uiteindelijke oplossing bestaat uit 1x (in mm): 119 NaCl, KCl 2,5, 3,2 MgCl2, 0,25 CaCl2, 12 D-glucose, 0,2 L-ascorbinezuur, 12 HEPES. Stel de pH op 7,4 (met NaOH), en pas osmolariteit tot 260 mOsm (met behulp van H 2 O en 10x voorraad-oplossing). </li><li> Weeg 3% laag gelerend temperatuur agar (Agarose type ...

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

Een kritische en moeilijke stap in ons protocol is de overdracht van het stuk van het netvlies in de agar-oplossing (protocol 3.4). Het is noodzakelijk om voorzichtig te verwijderen het glasvocht en het resterende slice-oplossing uit de retina stuk en over te dragen zonder vervorming of buigen. Om dit te bereiken, gebruiken we een kleine spatel (21-401-25B, Fisherbrand) met een tip gebogen tot een hoek van 90 ° vormen, samen met schuine punt tang (11251-35, Fine Science Tools), om de retinale positie s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Een lage-temperatuur-agar gelerend </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarose type VII-A </td></tr><tr><td> Patch pipet </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 1B150F-4 </td><td> Dikwandige (1,5 mm buitendiameter) borosilicaatglas </td></tr><tr><td> Verticale puller </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Tandartsen </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spring schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° gebogen fijne punt tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Scheermesje </td><td> Personna </td><td></td><td> Tweesnijdend, schoongemaakt met 70% ethanol en H 2 O </td></tr><tr><td> Cilindrische buis </td><td> Fisherbrand </td><td> 03 tot 338-1B </td><td> Polyethyleen monster flacons 2,5 ml </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome slicer </td><td> Leica </td><td> VT1000S of VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Rechtop microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x water-immersie objectief </td><td> Olympus </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0,90 </td></tr><tr><td> CCD-camera </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Camera controller </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;zwart en wit te controleren </td></tr><tr><td> Spuitfilter </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 micrometer </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Sutter Instrument </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lock-in versterker </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 versterkers hebben software-emulatie </td></tr><tr><td> Draaiende schijf laser confocale microscoop </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Live-cell imaging na patch clamp hele cel opname </td></tr><tr><td> Slidebook software </td><td> Intelligent Imaging Instruments (3i) </td><td></td><td> Imaging data-acquisitie en-analyse </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaatbufferoplossing </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost slide </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Schuif glas </td></tr><tr><td> Anti-fading agenten </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocale laser scanning microscoop </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> Beeldvorming van vaste weefsel </td></tr><tr><td> Spatel </td><td> Fisherbrand </td><td> 21 tot 401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel verticale slicer </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + gevoelige fluorescerende kleurstof </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A-20501MP </td><td> Fluorescerende kleurstof </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

Visuele prikkels worden gedetecteerd en getransporteerd over een breed dynamisch bereik van lichtintensiteiten en frequentie veranderingen door gespecialiseerde neuronen in de gewervelde netvlies. Twee klassen van retinale neuronen, fotoreceptoren en bipolaire cellen dit doen door gebruik ribbon-type actieve zones, waarvoor aanhoudende en high-throughput vrijkomen van neurotransmitters kunnen over langere periodes. ON-type gemengde bipolaire cel (Mb) terminals in de goudvis netvlies, die depolariseren aan het licht stimuli en te ontvangen gemengde staafjes en kegeltjes fotoreceptor inbreng, zijn geschikt voor de studie van de lint-type synapsen zowel vanwege hun grote omvang (~ 10-12 um diameter) en hun talrijke laterale en wederzijdse synaptische verbindingen met amacrine cel dendrieten. Directe toegang tot Mb bipolaire cel terminals in goudvissen netvlies plakken met de patch-clamp techniek maakt het mogelijk de meting van het presynaptische Ca 2 + stromingen, membraan capaciteit verandert, en wederzijdse feedback synaptische inhibitie gemedieerd door GABA &lt;sub&gt; A en GABA C-receptoren tot expressie gebracht op de terminals. Presynaptische membraan capaciteit metingen van exocytose toelaten dat een op de korte termijn plasticiteit van excitatoire neurotransmitters 14,15 bestuderen. Daarnaast kunnen op korte termijn en lange termijn plasticiteit van remmende neurotransmitter vrijlating uit amacrine cellen ook worden onderzocht door opnames van wederzijdse feedback inhibitie aankomst op de terminal Mb 21. Over korte tijd (bv. 10 ~ s), GABAergische wederzijdse feedback inhibitie van amacrine cellen ondergaat gepaarde puls depressie via GABA blaasje zwembad uitputting 11. De synaptische dynamiek van retinale microcircuits in de binnenste laag van plexiform het netvlies kan dus direct worden bestudeerd. De hersenen-slice techniek was meer dan 40 jaar geleden geïntroduceerd, maar is nog altijd zeer bruikbaar voor het onderzoek van de elektrische eigenschappen van neuronen, zowel op de enkele cel soma, een dendriet of axon, en microcircuit synaptische level 19. Weefsels die zijn te klein om direct te verlijmen op de kamer snijden vaak de eerste ingebed in agar (of geplaatst op een filtreerpapier) en vervolgens in plakjes gesneden 20, 23, 18, ​​9. In deze video, we gebruik van de pre-embedding agar techniek met behulp van goudvissen netvlies. Een deel van de reus bipolaire cel terminals in onze plakjes van goudvissen retina zijn axotomized (axon-cut) tijdens het snijden procedure. Dit laat ons toe om enkele presynaptische zenuwuiteinde ingangen te isoleren, omdat het opnemen van axotomized terminals sluit de signalen van de soma-dendritische compartiment. Als alternatief kan men ook opnemen uit intacte Mb bipolaire cellen, door het opnemen van de terminals aan axonen die niet zijn gesneden tijdens het snijden procedure. In het algemeen zal het gebruik van dit experimenteel protocol hulp in studies van retinale synaptische fysiologie, microschakeling functionele analyse, en synaptische transmissie bij lint synapsen.

Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...