Name: patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00
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Nous remercions le Dr Fred Rieke pour son explication sorte de l&#39;agar-embedded préparation de tranches rétine lorsque nous avons commencé en utilisant le protocole dans notre laboratoire. Nous remercions aussi Lori Vaskalis pour l&#39;illustration de schéma aperçu, et les Drs. Veeramuthu Balakrishnan et Soyoun Cho pour leurs précieux commentaires sur le texte et la vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH RO1 IEN-, et a également été partiellement financé par une subvention Korea Research Foundation financée par le gouvernement coréen [KRF-2008-357-E00032].

1. Solutions internes et externes <ol><li> Préparer la solution de tranchage (calcium) de solution mère 10x et ajouter MgCl 2, CaCl 2, et le D-glucose quotidien. La solution finale se compose de 1x (en mM): NaCl 119, KCl 2,5, 3,2 MgCl 2, CaCl 2 0,25, 12 D-glucose, 0,2 acide L-ascorbique, 12 HEPES. Régler le pH à 7.4 (avec NaOH), et ajuster l&#39;osmolarité de 260 mOsm (en utilisant H 2 O et de la solution stock de 10x). </li><li> Peser 3% à faible températu...

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. 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S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

Une étape cruciale et difficile dans notre protocole est le transfert de la pièce de la rétine dans la solution d&#39;agar (protocole 3.4). Il est nécessaire de retirer délicatement le corps vitré et la solution tranche résiduelle de la pièce de la rétine et le transférer sans distorsion ou de flexion. Afin d&#39;accomplir cela, nous utilisons une petite spatule (21-401-25B, Fisherbrand) avec une pointe recourbée pour former une angle de 90 °, avec une pince la pointe inclinée (11251-35, Ou...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Basse température gélifiant agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarose de type VII-A </td></tr><tr><td> Patch pipette </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B150F-4 </td><td> Paroi épaisse (1,5 mm de diamètre extérieur) en verre borosilicate </td></tr><tr><td> Extracteur vertical </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Cire dentaire </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux de printemps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> Coudée à 45 ° pince à pointe fine </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Lame de rasoir </td><td> Personna </td><td></td><td> À double tranchant, nettoyés avec de l&#39;éthanol 70% et H 2 O </td></tr><tr><td> Tube cylindrique </td><td> Fisherbrand </td><td> 03 à 338-1B </td><td> Flacons en polyéthylène de 2,5 ml </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome trancheuse </td><td> Leica </td><td> VT1000S ou VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x eau objectif à immersion </td><td> Olympus </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Caméra de contrôleur </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;moniteur noir et blanc </td></tr><tr><td> Filtre seringue </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 um </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Instrument Sutter </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur lock-in </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 amplificateurs ont un logiciel d&#39;émulation </td></tr><tr><td> Spinning microscope confocal à disque laser </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Imagerie des cellules vivantes, après l&#39;enregistrement patch clamp de cellules entières </td></tr><tr><td> Slidebook logiciels </td><td> Intelligent Imaging Instruments (3i) </td><td></td><td> Imagerie d&#39;acquisition de données et d&#39;analyse </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Solution tampon de phosphate </td><td> IGBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Glisser Superfrost </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Lame de verre </td></tr><tr><td> Des agents anti-décoloration </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocale à balayage laser Microscope </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> L&#39;imagerie de tissus fixés </td></tr><tr><td> Spatule </td><td> Fisherbrand </td><td> 21 à 401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel verticales trancheuse </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + colorant sensible fluorescents </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> Un 20501MP- </td><td> Colorant fluorescent </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

Les stimuli visuels sont détectés et transporté sur une large plage dynamique des intensités de lumière et les variations de fréquence par des neurones spécialisés dans la rétine des vertébrés. Deux classes de neurones rétiniens, les photorécepteurs et les cellules bipolaires, accomplir ceci en utilisant un ruban de type zones actives, qui permettent la libération des neurotransmetteurs soutenue et à haut débit sur de longues périodes. SUR-type mixte bipolaire cellule (Mo) de terminaux dans la rétine des poissons rouges, qui dépolarise à des stimuli lumineux et recevoir tige mixtes et l&#39;entrée des photorécepteurs cônes, sont appropriés pour l&#39;étude de ruban de type synapses tant en raison de leur grande taille (~ 10-12 um de diamètre) et à leurs nombreuses latéraux et réciproque connexions synaptiques avec les dendrites des cellules amacrines. L&#39;accès direct aux terminaux Mb cellule bipolaire en tranches le poisson rouge de la rétine avec la technique de patch-clamp permet la mesure de Ca 2 + présynaptiques courants, les changements de capacitance de membrane, et la rétro-inhibition réciproque synaptique médiée par le GABA &lt;sub&gt; A et récepteurs GABA C exprimée sur les bornes. Présynaptiques mesures capacitance membranaire de l&#39;exocytose permettent d&#39;étudier la plasticité à court terme de la libération des neurotransmetteurs excitateurs 14,15. De plus, la plasticité à court terme et à long terme de la libération du neurotransmetteur inhibiteur des cellules amacrines peut aussi être étudiée par les enregistrements de la rétro-inhibition réciproque arrivant au terminal Mb 21. Plus de courtes périodes de temps (par exemple, ~ 10 s), la rétro-inhibition GABAergique réciproque de cellules amacrines subit double choc de dépression à travers l&#39;épuisement des vésicules piscine GABA 11. La dynamique de microcircuits synaptique rétinienne dans la couche plexiforme interne de la rétine peut donc être étudiées directement. La technique du cerveau-tranche a été introduit plus de 40 ans mais est encore très utile pour les enquêtes sur les propriétés électriques des neurones, à la fois au corps cellulaire unique, simple ou dendrite axone, et microcircuit niveau synaptique 19. Les tissus qui sont trop petits pour être collé directement sur ​​la chambre de tranchage sont souvent les premiers embarqués dans l&#39;agar (ou placé sur un papier filtre), puis en tranches 20, 23, 18, ​​9. Dans cette vidéo, nous employons la technique agar pré-enrobage en utilisant la rétine des poissons rouges. Certaines des bornes géantes cellules bipolaires dans nos tranches de la rétine poissons rouges sont axotomisés (axone-cut) pendant la procédure de découpage. Cela nous permet d&#39;isoler seule terminaison nerveuse présynaptique entrées, parce que l&#39;enregistrement à partir de terminaux axotomisés exclut les signaux à partir du compartiment soma-dendritique. Alternativement, on peut également enregistrer à partir intactes les cellules bipolaires Mb, en enregistrant à partir de terminaux attachés à axones qui n&#39;ont pas été coupés lors de la procédure de trancher. Globalement, l&#39;utilisation de ce protocole expérimental d&#39;aide dans les études de la physiologie synaptique rétinienne, microcircuit analyse fonctionnelle, et la transmission synaptique dans les synapses de ruban.

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Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l&#39;agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l&#39;électrophysiologie et d&#39;imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d&#39;étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l&#39;aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.

Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

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Neurosciences

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Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

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