Name: patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00
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Agradecemos al Dr. Fred Rieke por su explicación del tipo de agar-integrado rebanada preparación retina cuando empezamos a usar el protocolo en nuestro laboratorio. También queremos agradecer a Lori Vaskalis de la ilustración esquemática de la visión y los Dres. Veeramuthu Balakrishnan y Cho Soyoun por sus valiosos comentarios sobre el texto y vídeo. Este trabajo fue apoyado por una beca de NEI-NIH RO1, y también fue parcialmente financiado por una beca de la Fundación de Investigación Corea financiado por el Gobierno de Corea [KRF-2008-357-E00032].

1. Soluciones externas e internas <ol><li> Prepare una solución de corte (calcio) de la solución madre 10 veces y añadir MgCl2, CaCl2, y D-glucosa al día. La solución final consiste en 1x (en mM): NaCl 119, KCl 2,5, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glucosa, 0,2 L-ácido ascórbico, 12 HEPES. Ajuste el pH a 7.4 (con NaOH), y ajustar la osmolaridad de 260 mOsm (con H 2 O y la solución stock 10x). </li><li> Pesar 3% de baja temperatura de gelificación-agar (agarosa tipo VII...

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	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. 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S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

Un paso crítico y difícil en nuestro protocolo es la transferencia de la pieza de la retina en la solución de agar (protocolo 3.4). Es necesario retirar cuidadosamente el humor vítreo y la solución de parte residual de la pieza de la retina y la transferencia sin la distorsión o curvatura. Para lograr esto, utilizamos una pequeña espátula (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta doblada para formar un ángulo de 90 °, junto con unas pinzas punta angulada (11251-35, Herramientas de Ciencias Artes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Baja la temperatura de gelificación-agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarosa Tipo VII-A </td></tr><tr><td> Parche pipeta </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 1B150F-4 </td><td> De paredes gruesas (1,5 mm de diámetro exterior) de vidrio de borosilicato </td></tr><tr><td> Extractor vertical </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Para improntas dentales </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Primavera tijeras </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> Ángulo de 45 ° pinzas de punta fina </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> Hoja de afeitar </td><td> Personna </td><td></td><td> De doble filo, se limpiaron con etanol al 70% y H 2 O </td></tr><tr><td> Tubo cilíndrico </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> Frascos de polietileno de 2,5 ml de muestra </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome cortadora </td><td> Leica </td><td> VT1000S o VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x de inmersión en agua objetiva </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara de control </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;monitor en blanco y negro </td></tr><tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 m </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Sutter instrumento </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador lock-in </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 amplificadores disponen de emulación de software </td></tr><tr><td> Disco giratorio microscopio láser confocal </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Imágenes de células vivas después de la grabación de patch clamp de células enteras </td></tr><tr><td> Slidebook software </td><td> Inteligente de imágenes Instruments (3i) </td><td></td><td> Imágenes de adquisición de datos y análisis </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Solución tampón fosfato </td><td> GIBCO </td><td> 70013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost diapositivas </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Portaobjetos de vidrio </td></tr><tr><td> Anti-fading agentes </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Láser confocal de barrido microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> Imágenes de tejidos fijados </td></tr><tr><td> Espátula </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel cortadora vertical, </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + colorante fluorescente sensible </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 Hydrazide </td><td> Invitrogen </td><td> A 20501MP- </td><td> Colorante fluorescente </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

Los estímulos visuales se detectan y se transmite en un amplio rango dinámico de la intensidad de la luz y los cambios de frecuencia por las neuronas especializadas en la retina de los vertebrados. Dos clases de neuronas de la retina, los fotorreceptores y las células bipolares, lograr esto mediante el uso de cinta de las zonas de tipo activo, que permiten la liberación de neurotransmisores sostenido y de alto rendimiento durante largos periodos de tiempo. ON-tipo mixto de células bipolares (Mb) terminales de la retina peces de colores, que despolarizar a los estímulos luminosos y recibir caña mezclado y la entrada del cono fotorreceptores, son adecuados para el estudio de la cinta de tipo sinapsis debido a su gran tamaño (~ 10-12 m de diámetro) y de sus numerosas conexiones sinápticas lateral y recíproca con las dendritas de células amacrinas. Acceso directo a las terminales Mb células bipolares en la retina rebanadas de peces de colores con la técnica de patch-clamp permite la medición de la presináptica Ca 2 + corrientes, cambios de membrana de la capacitancia, y la inhibición recíproca retroalimentación sináptica mediada por GABA &lt;sub&gt; A y los receptores GABA C, expresada en los terminales. Presináptica mediciones de la capacitancia de la membrana de la exocitosis permitir un estudio de la plasticidad a corto plazo de la liberación de neurotransmisores excitatorios 14,15. Además, la plasticidad a corto plazo y largo plazo de la liberación de neurotransmisores inhibitorios de las células amacrinas también pueden ser investigados por las grabaciones de la inhibición por retroalimentación recíproca de llegar a la terminal Mb 21. En períodos cortos de tiempo (por ejemplo, ~ 10 s), la inhibición GABAérgica retroalimentación recíproca de las células amacrinas se somete a dos a dos pulsos a través de la depresión el agotamiento del pool de vesículas del GABA 11. La dinámica sináptica de microcircuitos de la retina en la capa plexiforme interna de la retina por lo tanto puede ser estudiado directamente. La técnica de corte cerebral se introdujo más de 40 años, pero sigue siendo muy útil para la investigación de las propiedades eléctricas de las neuronas, tanto en el soma celular único, dendrita o axón único, y microcircuit sináptica nivel 19. Los tejidos que son demasiado pequeños para ser pegado directamente en la cámara de corte son a menudo primero incrustado en agar (o coloca en un papel de filtro) y luego en rodajas 20, 23, 18, ​​9. En este video, que emplean la técnica de agar antes de la incorporación de la retina con peces de colores. Algunos de los terminales de células gigantes bipolar en nuestra retina rebanadas de peces de colores son axotomized (axón de corte) durante el procedimiento de corte. Esto nos permite aislar una sola entrada presináptica terminales nerviosas, porque la grabación de las terminales axotomized excluye las señales del compartimiento de la soma-dendríticas. Por otra parte, también se puede grabar desde intacta Mb células bipolares, mediante el registro de los terminales conectados a los axones que no se han reducido durante el procedimiento de corte. En general, el uso de este protocolo experimental que ayuda en los estudios de la fisiología de la retina sináptica, el análisis de microcircuitos funcionales, y la transmisión sináptica en las sinapsis de la cinta.

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Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualización de la Dinámica en Endosoma Vivir terminaciones nerviosas con imágenes de fluorescencia en cuatro dimensiones

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Aplicación de la abrazadera de parche guiada por imágenes automatizada para el estudio de neuronas en cortes cerebrales

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...