Name: patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Vi tackar Dr Fred Rieke för hans vänliga förklaring av agar inbäddade-retinal slice förberedelser när vi började använda protokollet i vårt laboratorium. Vi tackar också Lori Vaskalis för illustration av schematisk överblick och Dr. Veeramuthu Balakrishnan och Soyoun Cho för värdefulla kommentarer på texten och video. Detta arbete stöddes av ett NEI-NIH RO1 bidrag, och var också delvis av en Korea Research Foundation som finansieras av Sydkoreas regering [KRF-2008-357-E00032].

1. Externa och interna lösningar <ol><li> Förbered skivning lösning (lågt kalcium) från 10x stamlösningen och tillsätt MgCl 2, CaCl 2, och D-glukos dagligen. Den slutliga 1x Lösningen består av (i mm): 119 NaCl, 2,5 KCl, 3,2 MgCl 2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glukos, 0,2 L-askorbinsyra, 12 HEPES. Ställ pH till 7,4 (med NaOH) och justera osmolalitet till 260 mOsm (med H 2 O och 10x stamlösning). </li><li> Väg upp 3% låg gelbildande temperatur agar (agaros typ V...

<ol>
	<li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levodopa+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson's+disease.">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster,+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department,+Ageing+and+Life+Course+.">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course .</a> Active ageing: a policy framework. , (2002).</li><li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+disorders:+advances+in+cause+and+treatment.">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. 9, 6-7 (2010).</li><li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson's+disease:+problems+with+the+current+model.">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, 22-32 (2000).</li><li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA.">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li><li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson's+disease.">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li><li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry.">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. , (2011).</li><li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+mass+spectrometry:+molecular+snapshots+of+biochemical+systems.">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li><li>Ljungdahl, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson's+Disease.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653-e25653 (2011).</li><li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proteins+directly+from+tissue:+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry.">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li><li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides:+3D+volume+reconstruction.">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li><li>Deininger, S. -. O., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).</li><li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis.">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li><li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics.">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li><li>Li, H., Chen, S., Hong, D., Li, M., Shyr, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Binning Software GAB. , (2012).</li><li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response.">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li><li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P.">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides.">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li><li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry.">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li></ol>

Ett kritiskt och svårt steg i våra protokoll är överföring av del av näthinnan i agar lösningen (protokoll 3,4). Det är nödvändigt att noggrant avlägsna glaskroppen och återstående skiva lösning från retinala pjäsen och den överförs utan förvrängning eller böjning. För att åstadkomma detta använder vi en liten spatel (21-401-25B, Fisherbrand) med en spets böjd att bilda en 90 ° vinkel, tillsammans med vinklad spets pincett (11.251-35, Fine Science Tools), att placera näthinnan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Låg gelbildande temperatur agar </td><td> Sigma </td><td> A0701 </td><td> Agarosen typ VII-A </td></tr><tr><td> Patch pipett </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 1B150F-4 </td><td> Tjockväggiga (1,5 mm ytterdiameter) borsilikatglas </td></tr><tr><td> Vertikal avdragare </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> Dentalvax </td><td> CAVEX </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Våren sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° vinklat fin spets tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.251-35 </td><td></td></tr><tr><td> RAKBLAD </td><td> Personna </td><td></td><td> Tveeggat, rengörs med 70% etanol och H 2 O </td></tr><tr><td> Cylindriskt rör </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338-1B </td><td> Polyeten prov flaskor 2,5 ml </td></tr><tr><td> Hyaluronidas </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome skivare </td><td> Leica </td><td> VT1000S eller VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Upprätt mikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x vatten nedsänkning mål </td><td> Olympus </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0,90 </td></tr><tr><td> CCD-kamera </td><td> Sony </td><td> XC-75 </td><td></td></tr><tr><td> Kamera controller </td><td> Hamamatsu </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> Övervaka &lt;/ Td&gt; <td> Sony </td><td></td><td> 13 &quot;svartvit monitor </td></tr><tr><td> Sprutfilter </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0,2 ìm </td></tr><tr><td> Mikromanipulator </td><td> Sutter Instrument </td><td> MPC-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lås förstärkare </td><td> Heka </td><td></td><td> EPC-9/10 förstärkare har programvaruemulering </td></tr><tr><td> Spinning disk laser konfokalmikroskop </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-X1 </td><td> Levande cell imaging efter patch clamp helcells inspelning </td></tr><tr><td> Slidebook programvara </td><td> Intelligent Imaging Instruments (3i) </td><td></td><td> Imaging datainsamling och analys </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatbuffertlösning </td><td> GIBCo </td><td> 70.013 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost bild </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Skjut glas </td></tr><tr><td> Anti-blekning agenter </td><td> Biomeda corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Konfokala laser-scanning mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td> Avbildning av fixerat </td></tr><tr><td> Stekspade </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401-25B </td><td></td></tr><tr><td> Manuel vertikala skivare </td><td> Narishige </td><td> ST-20 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Grön 488 BAPTA-1 </td><td> Invitrogen </td><td> O-6806 </td><td> Ca 2 + känsliga fluorescerande färg </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 555 hydrazid </td><td> Invitrogen </td><td> A-20501MP </td><td> Fluorescerande färg </td></tr></tbody></table>

patch-clamp capacitance measurements and ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices

Visuella stimuli upptäcks och förmedlas över ett brett dynamiskt omfång av ljusintensiteter och förändringar ofta av specialiserade nervceller i ryggradsdjur näthinnan. Två klasser av näthinnans nervceller, fotoreceptorer och celler bipolär, åstadkomma detta genom att använda band-typ aktiva zoner, som möjliggör uthållig och hög genomströmning frisättningen av neurotransmittorer under långa tidsperioder. ON-typ blandad bipolär cell (Mb) terminaler i guldfisk näthinnan, som depolarize till ljus stimuli och får blandas tappar och stavar photoreceptor ingång, är lämpliga för studier av band-typ synapser både på grund av sin storlek (~ 10-12 ìm diameter) och deras många sidled och ömsesidiga synapsförbindelser med amakrina cell dendriter. Direkt tillgång till MB bipolär cell terminaler i Goldfish retinal skivor med patch-clamp teknik möjliggör mätning av presynaptiska Ca 2 + strömmar, membran förändringar kapacitans, och ömsesidig synaptiska feedback-hämning medierad av GABA &lt;sub&gt; A och GABA C-receptorer uttrycks på terminalerna. Presynaptiska membranet kapacitans mätningar av exocytos tillåter en att studera den kortsiktiga plasticitet i excitatoriska neurotransmittorn släppa 14,15. Dessutom kan kortsiktiga och långsiktiga plasticitet i inhibitoriska neurotransmittorn befrielse från amakrina celler också utredas av inspelningar av ömsesidig återkoppling hämning anländer till Mb plint 21. Under korta perioder (t.ex. ~ 10 s), genomgår GABAergic ömsesidig återkoppling hämning från amakrina celler parade puls depression via GABA vesikler poolen utarmning 11. Den synaptiska dynamik retinal mikrokretsar i den inre plexiform lagret av näthinnan kan därför vara direkt studeras. Hjärnan-slice tekniken infördes mer än 40 år sedan men är fortfarande mycket användbar för undersökning av de elektriska egenskaperna hos nervceller, både på det enda cell soma, enkel Dendrite eller axon, och microcircuit synaptisk nivå 19. Vävnader som är för små för att limmas direkt på skivning kammaren ofta först inbäddade i agar (eller placeras på ett filtrerpapper) och sedan skivade 20, 23, 18, ​​9. I denna video använder vi före inbäddning agar teknik med guldfiskar näthinnan. Några av de gigantiska bipolära cellen terminaler i våra skivor av guldfisk näthinnan är axotomized (axon-cut) under skärning förfarandet. Detta tillåter oss att isolera enstaka presynaptiska ingångar nervändslut, eftersom inspelning från axotomized terminaler utesluter signalerna från soma-dendritiska facket. Alternativt kan en post även från intakta Mb bipolära celler, genom att spela in från depåer knutna till axoner som inte har sänkts under skivning förfarandet. Totalt sett kommer att använda denna experimentella protokoll stöd i studierna av näthinnans synaptiska fysiologi, mikrokrets funktionell analys och synaptisk transmission på band synapser.

Watch this Scientific Journal Video about Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices at JoVE.com

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Här beskriver vi ett protokoll för beredning av agar inbäddade-retinal skivor som är lämpliga för elektrofysiologi och Ca2 + avbildning. Denna metod gör att man kan studera band-typ synapser i näthinnan mikrokretsar med direkt patch-clamp inspelningar av enstaka presynaptiska nervändslut.

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Kopplade Patch Clamp Inspelningar från Motor-neuron och Target skelettmuskulaturen i Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Visualisering av endosome Dynamics i Living nervterminaler med Fyrdimensionell fluorescens avbildning

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Metoder för Cell-anslutna Mått kapacitans i Mouse Adrenal kromaffina Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro och morfologisk karakterisering av neurala Microcircuits i akut hjärnan skivor Använda Kopplade Patch-Clamp Inspelningar

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Inspelning Ljus framkallade Postsynaptiska svar i nervceller i Dark-anpassade, mus näthinnan Slice Förberedelser Använda Patch Clamp Tekniker

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...