Name: parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00
Duration: 12 min 43 s
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Les auteurs tiennent à remercier Joe Owen dans l&#39;Instrument biomédicales et atelier d&#39;usinage pour ses efforts inlassables dans l&#39;usinage et l&#39;assemblage des parties chambre d&#39;écoulement et Matt Maudsley de Leica Microsystems pour aider dans les techniques d&#39;image à travers les cellules chambres d&#39;écoulement. Nous sommes redevables à Kevin Collins à partir des services de perfusion Duke et Steve Wallace dans le Département de génie biomédical pour des suggestions utiles sur la conception du circuit d&#39;écoulement. Nous tenons également à remercier la National Science Foundation Graduate Programme de bourses de recherche pour soutenir Alexandra Jantzen et le NIH pour leur soutien par le biais de subvention &quot;doublure autologue CBE afin d&#39;améliorer la biocompatibilité des dispositifs d&#39;assistance circulatoire&quot; RC1HL099863-01.

<ol>
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Notre circuit d&#39;écoulement et de la chambre de flux nous permet de soumettre des cellules adhérentes, EPC, par exemple, pour définir des contraintes de cisaillement du fluide. Depuis le sommet de chambre et le fond sont transparents, l&#39;adhésion cellulaire et de morphologie peuvent être évalués soit en temps réel, à travers la chambre elle-même, ou après une expérience de débit et de démontage de la chambre de circulation. A ce stade, les cellules peuvent être récoltées dans des conditions stériles et soit re-plaqué, ou utilisés pour recueillir leur ADN ou d&#39;ARN, etc, pour une analyse ultérieure. Pour parvenir à un écoulement laminaire, la conception de la chambre doit être telle que plusieurs conditions soient remplies. Tout d&#39;abord, le débit doit être laminaire, ce qui peut être vérifié par le calcul de son nombre de Reynolds (Re), qui est le rapport des forces d&#39;inertie aux forces visqueuses. (Si les forces visqueuses prédominent, Re est faible et l&#39;écoulement est laminaire ou «totalement développé» - habituellement pour Re &lt;2300.Si les forces d&#39;inertie dominent, l&#39;écoulement devient de plus en plus aléatoire jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit turbulent, comme c&#39;est le cas pour Re&gt; 4000). Nous pouvons calculer Re, selon l&#39;équation 3 8, <img alt="Équation 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Où ρ est la densité du fluide, Q est le débit, μ est la viscosité, L et H sont la largeur et la hauteur de la chambre, respectivement, et D h est le diamètre hydraulique, défini selon l&#39;équation 4 8, <img alt="L&#39;équation 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> Le nombre de Reynolds de nos chambres d&#39;écoulement trois, avec des hauteurs allant de 166 à 267 um, large de 13,9 à 34,6 à des débits calculated d&#39;obtenir une contrainte de cisaillement de 15 dynes / cm 2. A des débits calculés pour une contrainte de cisaillement de 100 dynes / cm 2, le nombre de Reynolds des chambres varie de 90,4 à 234. Tous ces nombres de Reynolds sont bien inférieurs à 2300 et répond au critère de l&#39;écoulement laminaire. Deuxièmement, pour le champ de vitesse et la contrainte de cisaillement à être indépendant de la distance le long du canal d&#39;écoulement (ie complètement développé), la distance de l&#39;entrée de fluide à la diapositive doit être plus long que la longueur d&#39;entrée, e L. Cela peut être satisfaite par le calcul de la longueur de l&#39;entrée, selon l&#39;équation 5 9. <img alt="Équation 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Pour les valeurs énumérées ci-dessus, la longueur d&#39;entrée varie de 0,01 à 0,25 cm. Troisièmement, afin de s&#39;assurer que la vitesse et la contrainte de cisaillement dans la direction latérale ne varient passignificativement de la valeur pour un débit de canal unidimensionnel (Ph Δ / 2L), le ratio H / W doit être bien inférieure à 1. Pour la contrainte de cisaillement moyenne de paroi dans des conditions d&#39;écoulement à deux dimensions à 95% de la contrainte de cisaillement mur sous unidimensionnelle, h / w doit être égale à 0,10, et pour la contrainte de cisaillement mur sous des conditions d&#39;écoulement à deux dimensions pour être 97,5% de la contrainte de cisaillement mur sous unidimensionnelle, h / w doit être égale à 0,05. Avec les dimensions de notre chambre d&#39;écoulement conçus 1,7 cm de largeur et de 166 à 267 um de hauteur, ces critères sont satisfaits. La pression varie seulement dans le sens d&#39;écoulement s&#39;il n&#39;ya pas de gradients de pression latérale à l&#39;entrée. Cela peut être évaluée en utilisant des colorants ou des particules dans le chemin d&#39;écoulement. En outre, pour des expériences de flux constant, un amortisseur d&#39;impulsions est inséré dans le circuit d&#39;écoulement. L&#39;amortisseur d&#39;impulsions sort la plupart des pulsatility provoqué par la pompe à rouleaux dans le circuit, et nous permet de rapprocher l&#39;hypothèse d&#39;un débit constant. Fait à noter, l&#39;amortisseur d&#39;impulsions utilisé doit être compatible avec la pompe et les tubes utilisés dans le circuit, de sorte qu&#39;il peut éliminer efficacement les pulsations dans le flux de sortie pour les fréquences spécifiques de la pompe à rouleaux. Dans notre démonstration de la Masterflex L / S amortisseur d&#39;impulsions réalise un écoulement laminaire lorsqu&#39;il est utilisé sur la ligne de refoulement avec une pompe Masterflex série L / S (0 à 600 RPM) et I / P 26 tubes. Pour un flux pulsatile, une pompe programmable peut être utilisée pour générer des signaux différents. Pour un flux pulsatile, une pompe programmable peut être utilisée pour générer des signaux différents. Par ailleurs, le circuit est conçu de telle sorte que des échantillons de perfusat peuvent être facilement recueillies à différents moments sans risque de contamination des cellules ou moyen débit. Dans notre exemple, la concentration de NO 2 - a été mesurée par chimioluminescence avecun analyseur de Ionics / Sievers d&#39;Oxyde Nitrique (NOA 280, Instruments Sievers, Boulder, CO), comme décrit précédemment 10. Le réducteur utilisé pour l&#39;analyse des nitrites a été l&#39;iodure de potassium dans l&#39;acide acétique (14,5 M d&#39;acide acétique et de 0,05 M KI), qui a le potentiel de réduction de convertir nitrite en NO, mais est insuffisante pour réduire les oxydes d&#39;azote plus élevé tels que les nitrates et est donc relativement spécifique pour les nitrites. Le nitrite quantité totale produite a été calculée comme le produit de la concentration de produit et le volume total du circuit tout en ajustant pour la perte de volume tout en prenant des échantillons 6. Les étapes suivantes sont essentielles pour l&#39;exécution réussie des expériences de flux: <ol class="lroman"><li> Il est souhaitable d&#39;éviter la formation de bulles lors de la mise en place de flux, depuis les bulles ont le potentiel pour arracher les cellules de leur surface. Ceci peut être évité en prenant soin lorsque vous placez la partie supérieure de la chambre d&#39;écoulement sur la partie inférieure, qui est le mieuxaccomplie en gardant à la fois parallèles les uns aux autres et à abaisser le dessus sur le fond dans un mouvement sans réajustements. Ce faisant, petites bulles d&#39;air qui peuvent être présents et / ou flottant dans le canal d&#39;écoulement, sera détournée dans les pièges à bulles à chaque extrémité du boîtier en aluminium. </li><li> Il est important de s&#39;assurer que le tuyau d&#39;écoulement dans le réservoir descend au fond du réservoir. Sinon, l&#39;air peut être aspiré dans le tuyau qui mène à la chambre du réservoir si le niveau de perfusat tombe légèrement en dessous de l&#39;extrémité du tuyau. </li><li> Le chercheur doit se familiariser avec la direction du débit de la pompe pour que la pompe ne lancez accidentellement dans la direction opposée dès le début des flux, ce qui aboutirait à l&#39;air d&#39;être aspiré dans le circuit et la chambre. </li><li> Pour éviter la formation de mousse (en raison de protéines dénaturées contenues dans le sérum), nous vous conseillons de baisser le tuyau qui mène de la chambre au réservoir d&#39;environ un pouce au-dessus du perfusaniveau de te l&#39;intérieur du réservoir. Toutefois, le garder au-dessus du niveau moyen de flux vous permet de vérifier le débit dans le réservoir pendant l&#39;expérience. </li><li> Lors du vissage des pièces de chambre ensemble, il est important de saisir fermement le boîtier avec une main pendant le fonctionnement du tournevis électrique avec votre autre main. Notez que le mouvement du tournevis électrique sera traduit en couple qui a le potentiel de «jeter la chambre autour de« une fois que la vis est serrée. </li><li> Afin d&#39;éviter toute formation de vagues de pression dans le circuit et la levée des cellules hors de leur surface, s&#39;assurer que tous les robinets sont ouverts avant de commencer l&#39;écoulement. </li><li> Surtout pour les études de flux à plus long terme (&gt; 48 heures), nous vous recommandons d&#39;utiliser le tuyau de plus en plus résistants pour être inséré dans la tête de pompe pour éviter la rupture des tubes. </li><li> Il est possible que le tube «migre» dans la tête de la pompe due à de mauvais ajustés dents tête de pompe. Nous suggérons donc attentifs à la manière dont la baignoireING est fixé dans la tête de la pompe et le marquage de chaque extrémité du tube avec un marqueur tel que vous pouvez facilement constater si le tube est «tiré dans &#39;ou délogés pendant l&#39;expérience. </li><li> Toujours vérifier soigneusement chaque connecteur simple du circuit et de la chambre avant de commencer la perfusion afin d&#39;empêcher la fuite de liquide de perfusion lors d&#39;une expérience due à une mauvaise connexion. Ceci est particulièrement important pour les connecteurs d&#39;entrées et de sorties des amortisseurs pouls! </li><li> N&#39;oubliez pas de limite d&#39;exposition à la lumière si vous utilisez des étiquettes fluorescentes. </li></ol> Une éventuelle limitation de notre chambre d&#39;écoulement est que la hauteur est fixée par la hauteur du canal usiné dans l&#39;aluminium. Cependant, cela a l&#39;avantage de ne pas avoir à vérifier et à ajuster la hauteur du canal avant chaque expérience et simplifie donc le calcul des contraintes de cisaillement en se contentant de réglage du débit de la pompe à la valeur désirée. Selon vos objectifs de recherche, il peut être souhaitable deaugmentation de la contrainte de cisaillement, sans vitesse de la pompe augmente. Dans ce cas, nous recommandons d&#39;augmenter la viscosité du liquide de perfusion, par ex ajoutant dextran aux 11 moyennes. Une limitation possible du circuit de débit est le volume important de support utilisé, qui peut être problématique lorsque l&#39;on tente de quantifier de très faibles concentrations de métabolites de la cellule. Bien que non représenté ici, il est possible de réduire considérablement le volume du circuit en utilisant un plus petit réservoir et un amortisseur de pulsation et de diminuer la longueur du tube et le diamètre. De plus, il existe plusieurs autres systèmes disponibles dans le commerce qui peut être utilisé pour appliquer la contrainte de cisaillement du fluide dans les cellules en culture. Microfluidique à base de systèmes, par exemple le système d&#39;BioFlux Fluxion, permettre des analyses simultanées de cellules dans les différents canaux d&#39;écoulement microfluidique chargée avec une solution en plaques ainsi agir comme entrée et de sortie pour ces réservoirs 12,13,14 canaux. Cependant, les micro et d&#39;autressystèmes fluidiques sont pas compatibles avec des lames de microscope standard et ne permettent pas la récupération d&#39;un nombre suffisamment grand de cellules pour d&#39;autres expériences, comme la RT-PCR ou Western Blot. En outre, ils sont moins conviviaux, le coût d&#39;un minimum de 40 000 $ et peut atteindre un total de plus de 100.000 dollars, selon l&#39;équipement accessoire. Deux systèmes macrofluidic disponibles auprès de la Société internationale de Flexcell, le Streamer Flexcell et les systèmes FlexFlow, ont été utilisés avec succès pour étudier les cellules endothéliales 15,16,17, les cellules humaines anneau 18 et 19 fibroblastes dans des conditions d&#39;écoulement des fluides. Un troisième système, disponible via GlycoTech, a été utilisée pour étudier l&#39;adhérence des cellules tumorales 20 et adhérence des leucocytes de 21 à monocouches endothéliales. Le système permet streamer plusieurs diapositives pour être exécuté dans les mêmes conditions de cisaillement à la fois, mais il lui manque une fenêtre de visualisation et - contrairement à nosconception - ne permet pas de visualiser en temps réel des cellules sous écoulement. Le système FlexFlow a une fenêtre de visualisation, mais nécessite un microscope droit, qui pourrait ne pas être le microscope standard utilisé dans la plupart des laboratoires. En outre, le système nécessite FlexFlow une lamelle de cellules enduits d&#39;être inversée lorsqu&#39;il est placé dans la chambre de circulation. Cela empêche la visualisation des cellules fluorescentes sur une surface opaque, tels que le titane revêtu de verre, ce qui nous faisons preuve dans notre étude. Enfin, les lamelles spécialisés doivent être achetés spécifiquement pour le système FlexFlow, qui est dans la fourchette de prix de plusieurs milliers de dollars, semblable au système de streamer Flexcell. GlycoTech offre circulaires et rectangulaires chambres d&#39;écoulement à plaques parallèles, qui sont nettement moins chers, mais fabriqués à partir d&#39;acrylique moulé qui ne peuvent pas être convenablement la tige autoclavés comme notre chambre. Fait à noter, d&#39;autres chambres d&#39;écoulement qui ont été décrits pour être autoclavableapparaissent impraticables car ils nécessitent des lentilles spéciales microscopiques 22,23. Le système utilise des joints en caoutchouc GlycoTech de silicium interposé entre les plaques supérieure et inférieure, ce qui va changer dans l&#39;épaisseur avec un usage répété et donc modifier la hauteur de la chambre au cours du temps (le fabricant recommande l&#39;achat de nouveaux tous les dix utilisations). Notre chambre en aluminium avec haut-toriques permet une complète opposition de plaques supérieure et inférieure et assure hauteur de la chambre constant entre expériences. Enfin, les pompes à vide sont nécessaires pour obtenir un joint étanche dans de nombreux designs chambre de circulation, y compris les chambres GlycoTech, qui ne sont pas nécessaires dans notre conception. Attendu que non représenté ici, la chambre d&#39;écoulement peuvent être conservés sous un microscope pendant l&#39;expérience totalité du flux d&#39;images en temps réel de l&#39;adhésion cellulaire et / ou de comportement. Si cela est souhaité, nous recommandons d&#39;utiliser les lampes chauffantes ou d&#39;un coussin chauffé sous la chambre pour maintenir la température du perfusat à 37 ° C. Fourrurelà, la pompe à rouleaux peuvent être remplacés par une pompe seringue, si aucun «recirculation» des cellules ou des métabolites ou des médicaments expérimentaux ou des agents est souhaitée 24. Il est également possible de circuler cellules étiquetées différemment sur ​​les cellules adhérentes, par exemple, les plaquettes fluorescentes sur une couche de EPC confluentes (en utilisant le test décrit par Achneck plaquettes et al. 6,25) pour évaluer de cellule à cellule d&#39;interaction sous la contrainte de cisaillement du fluide. Notre chambre d&#39;écoulement combine des fonctionnalités précieuses des autres chambres de débit disponible, comme un port de prélèvement perfusat et une fenêtre de visualisation et a l&#39;avantage important de la compatibilité avec soit un microscope inversé ou debout. Il est entièrement autoclavable et permet à des expériences répétées à hauteur de la chambre constante et sans avoir besoin de pompes à vide pour obtenir un joint étanche.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produits / Réactifs </td><td> Société </td><td> Produit # </td></tr><tr><td> Seringue de 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Seringue </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way robinets </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> En alliage d&#39;aluminium </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Culture cellulaire Plats (4-même, rectangulaire) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Cellule Tracker orange </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Biologique Recherche </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Femme adaptateur Luer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Bouteille en verre (250 ml) avec Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubes dur </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst solutions anti-taches </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> FBS Hyclone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adaptateur Luer mâle </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Medium </td><td> Cellgro </td><td> 15 à 100-CV </td></tr><tr><td> Raccords en polypropylène Barbelé </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dampener </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pompe-Drive (lecteur Masterflex L / S l&#39;économie à vitesse variable) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Tête de pompe (Masterflex chef Facile pompe de charge) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Faites glisser </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tuyau souple </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Filtre seringue </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox orange Nucleic Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Trypsine EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Trypsine solution neutralisante </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

L&#39;objectif global de cette méthode est de décrire une technique à soumettre des cellules adhérentes aux conditions d&#39;écoulement laminaire et d&#39;évaluer leur réponse au cisaillement du fluide ainsi quantifiables souligne 1. Notre conception de la chambre de flux et de circuit d&#39;écoulement (Fig. 1) contient une zone de visualisation transparente qui permet de tester l&#39;adhésion cellulaire et l&#39;imagerie de la morphologie des cellules immédiatement avant l&#39;écoulement (Fig. 11A, B), à divers moments durant l&#39;écoulement (Fig. 11C) , et après l&#39;écoulement (Fig. 11D). Ces expériences sont illustrées avec cordon ombilical humain dérivés du sang des cellules progénitrices endothéliales (EPC) et les porcins EPC 2,3. Cette méthode est également applicable à d&#39;autres types de cellules adhérentes, par exemple, les cellules musculaires lisses (SMC) ou des fibroblastes. La chambre et toutes les parties du circuit sont facilement stérilisées à l&#39;autoclave à vapeur. Contrairement à d&#39;autreschambres, p.ex. chambres microfluidiques, un grand nombre de cellules (&gt; 1 million en fonction de la taille des cellules) peuvent être récupérés après l&#39;expérience de flux dans des conditions stériles pour culture cellulaire ou d&#39;autres expériences, par exemple, l&#39;ADN ou l&#39;extraction d&#39;ARN, ou immunohistochimie (fig. 11E), ou le balayage 5 microscopie électronique. La contrainte de cisaillement peut être ajustée en faisant varier le débit de la perfusion, la viscosité du fluide, ou la hauteur et la largeur de canal. Celui-ci peut réduire le volume de fluide ou de besoins tout en assurant que la cellule unidimensionnelle d&#39;écoulement est maintenu. Il n&#39;est pas nécessaire de mesurer la hauteur entre les expériences de chambre, car la hauteur de la chambre ne dépend pas de l&#39;utilisation de joints d&#39;étanchéité, ce qui augmente considérablement la facilité d&#39;expériences multiples. Par ailleurs, la conception du circuit permet facilement la collecte des échantillons de perfusat pour l&#39;analyse et / ou la quantification des métabolites sécrétés par les cellules sous-exposition du stress de cisaillement du fluide, par exemple, l&#39;oxyde nitrique (fig. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Nous décrivons une méthode pour objet des cellules adhérentes à la contrainte de cisaillement à flux laminaire dans un circuit à débit continu stérile. L&#39;adhérence des cellules, la morphologie peut être étudiée à travers la chambre transparente, des échantillons obtenus à partir du circuit pour l&#39;analyse de métabolites et cellules récoltées après une exposition de cisaillement pour les expériences futures ou la culture.

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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