Name: parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a Joe Owen no instrumento Biomédica e Machine Shop por seus esforços incansáveis ​​em usinagem e montagem das peças fluxo de câmara e Matt Maudsley da Leica Microsystems para auxiliar nas técnicas de imagem para as células através de câmaras de fluxo. Somos gratos a Kevin Collins dos Serviços de Perfusão Duke e Dr. Steve Wallace no Departamento de Engenharia Biomédica para sugestões úteis sobre projeto de circuito de fluxo. Gostaríamos também de agradecer à National Science Foundation Graduate Fellowship Program Research para apoiar Alexandra Jantzen e os NIH por seu apoio através de Grant &quot;forro autólogo EPC para melhorar a biocompatibilidade de dispositivos de assistência circulatória&quot; RC1HL099863-01.

<ol>
	<li>Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+avidin-biotin+as+a+heterogeneous+ligand+system+for+enhanced+endothelial+cell+adhesion.">Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).</li><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+stem+and+progenitor+cells.">Cord blood stem and progenitor cells.</a> Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).</li><li>Brown, M. A., Wallace, C. S., Angelos, M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+umbilical+cord+blood-derived+late+outgrowth+endothelial+progenitor+cells+exposed+to+laminar+shear+stress.">Characterization of umbilical cord blood-derived late outgrowth endothelial progenitor cells exposed to laminar shear stress.</a> Tissue. Eng. Part. A. 15, 3575-3587 (2009).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+titanium+ventricular+assist+device+surfaces+after+gold/palladium+coating+for+scanning+electron+microscopy.">Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 71-76 (2010).</li><li>Achneck, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+titanium+cardiovascular+devices+seeded+with+autologous+blood-derived+endothelial+progenitor+cells:+EPC-seeded+antithrombotic+Ti+Implants.">The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants.</a> Biomaterials. 32, 10-18 (2011).</li><li>Rinker, K. D., Prabhakar, V., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+contact+time+and+force+on+monocyte+adhesion+to+vascular+endothelium.">Effect of contact time and force on monocyte adhesion to vascular endothelium.</a> Biophys. J. 80, 1722-1732 (2001).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2004).</li><li>Truskey, G. A., Yuan, F., Katz, D. F., Horton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Transport Phenomena in Biological Systems. , (2009).</li><li>Allen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+nitrite+response+and+arterial+reactivity+differentiate+vascular+health+and+performance.">Plasma nitrite response and arterial reactivity differentiate vascular health and performance.</a> Nitric Oxide. 20, 231-237 (2009).</li><li>Xiao, Y., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+receptor-ligand+affinity+on+the+strength+of+endothelial+cell+adhesion.">Effect of receptor-ligand affinity on the strength of endothelial cell adhesion.</a> Biophys. J. 71, 2869-2884 (1996).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Adhesion+and+Aggregation+Under+Flow+using+Microfluidic+Flow+Cells.">Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1644-e1644 (2009).</li><li>Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. W. e. l. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plate-coupled+microfluidic+devices+designed+for+facile+image-based+cell+adhesion+and+transmigration+assays.">plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).</li><li>Conant, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+well-plate+microfluidic+devices+to+conduct+shear-based+thrombosis+assays.">Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays.</a> J. Lab. Autom. 16, 148-152 (2011).</li><li>Metaxa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-dependent+stimulation+of+endothelial+cell+proliferation+by+sustained+high+flow.">Nitric oxide-dependent stimulation of endothelial cell proliferation by sustained high flow.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 295, H736-H742 (2008).</li><li>Radel, C., Carlile-Klusacek, M., Rizzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Participation+of+caveolae+in+beta1+integrin-mediated+mechanotransduction.">Participation of caveolae in beta1 integrin-mediated mechanotransduction.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 358, 626-631 (2007).</li><li>Wang, X. L., Fu, A., Spiro, C., Lee, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Vascular+Endothelial+Cells-Effects+of+Laminar+Shear+Stress+and+High+Glucose.">Proteomic Analysis of Vascular Endothelial Cells-Effects of Laminar Shear Stress and High Glucose.</a> J. Proteomics. Bioinform. 2, 445-445 (2009).</li><li>Elfervig, M. K., Minchew, J. T., Francke, E., Tsuzaki, M., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+sensitizes+intervertebral+disc+annulus+cells+to+fluid-induced+shear+stress.">IL-1beta sensitizes intervertebral disc annulus cells to fluid-induced shear stress.</a> J. Cell. Biochem. 82, 290-298 (2001).</li><li>Archambault, J. M., Elfervig-Wall, M. K., Tsuzaki, M., Herzog, W., Banes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+tendon+cells+produce+MMP-3+in+response+to+fluid+flow+without+significant+calcium+transients.">Rabbit tendon cells produce MMP-3 in response to fluid flow without significant calcium transients.</a> J. Biomech. 35, 303-309 (2002).</li><li>Patton, J. T., Menter, D. G., Benson, D. M., Nicolson, G. L., McIntire, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computerized+analysis+of+tumor+cells+flowing+in+a+parallel+plate+chamber+to+determine+their+adhesion+stabilization+lag+time.">Computerized analysis of tumor cells flowing in a parallel plate chamber to determine their adhesion stabilization lag time.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 26, 88-98 (1993).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium.">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009-e1009 (2009).</li><li>Kaper, H. J., Busscher, H. J., Norde, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+poly(ethylene+oxide)+brushes+on+glass+surfaces+and+adhesion+of+Staphylococcus+epidermidis.">Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 14, 313-324 (2003).</li><li>Bakker, D. P., Plaats, A. v. a. n. d. e. r., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+velocity+profiles+for+different+flow+chamber+designs+used+in+studies+of+microbial+adhesion+to+surfaces.">Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).</li><li>Angelos, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+adhesion+of+umbilical+cord+blood+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+shear+stress.">Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress.</a> Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).</li><li>Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+fluorescent+method+to+internally+label+platelets+suitable+for+physiological+measurements.">A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements.</a> Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).</li></ol>

Produção e acesso gratuito deste vídeo-artigo é patrocinado pela Co. Instrumento Cole-Parmer

O nosso circuito de fluxo e câmara de fluxo nos permitem assunto células aderentes, EPCs por exemplo, para tensões de cisalhamento definida fluido. Desde o compartimento superior e inferior são de adesão, transparente e morfologia celular pode ser avaliado tanto em tempo real, através da câmara em si, ou depois de uma experiência de fluxo e desmontagem da câmara de fluxo. Nesse ponto, as células podem ser colhidas em condições estéreis e ou re-banhado, ou usado para coletar seu DNA ou RNA, etc, para posterior análise. Para conseguir um fluxo laminar, o desenho da câmara deve ser tal que várias condições sejam cumpridas. Primeiro, o fluxo deve ser laminar, que pode ser verificado através do cálculo o número de Reynolds (Re), que é a razão entre forças inerciais às forças viscosas. (Se as forças viscosas predominam, Re é pequeno eo fluxo é laminar ou &#39;plenamente desenvolvido&#39; - geralmente para Re &lt;2300.Se as forças de inércia predominam, o fluxo se torna mais e mais aleatória até que seja turbulento, como é o caso para Re&gt; 4000). Podemos calcular Re acordo com a equação 3 8, <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Onde ρ é a densidade do fluido, Q é a vazão, μ é a viscosidade, w e h são a largura ea altura da câmara, respectivamente, e D h é o diâmetro hidráulico, definido de acordo com a equação 4 8, <img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> O número de Reynolds do nosso fluxo de câmaras de três, com alturas que variam de 166-267 M, faixa 13,9-34,6 a taxas de fluxo de calculated para obter uma tensão de cisalhamento de 15 dinas / cm 2. Em taxas de fluxo calculado para uma tensão de cisalhamento de 100 dinas / cm 2, o número de Reynolds das câmaras variou de 90,4-234. Todos estes números são muito mais baixos Reynolds de 2300 e atender o critério de fluxo laminar. Segundo, para o campo de velocidade e tensão de cisalhamento para ser independente da distância ao longo do canal de fluxo (ou seja, totalmente desenvolvido), a distância entre a entrada de líquido para o slide deve ser maior que o comprimento de entrada, e L. Isto pode ser satisfeita por meio do cálculo do comprimento de entrada, conforme a equação 5 9. <img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Para os valores listados acima, o comprimento de entrada varia de 0,01 a 0,25 centímetros. Terceiro, a fim de garantir que a velocidade ea tensão de cisalhamento na direção laterais não variamsignificativamente do valor de fluxo unidimensional canal (Δ Ph / 2L), a relação h / w deve ser muito menor que 1. Para a tensão média de cisalhamento de parede em condições bidimensionais fluxo a ser de 95% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,10, e para a tensão de cisalhamento de parede em condições bidimensionais de fluxo para ser 97,5% da tensão de cisalhamento parede sob unidimensional de fluxo, h / w deve ser igual a 0,05. Com as dimensões da nossa câmara de fluxo projetado 1,7 centímetros de largura e 166-267 M de altura, estes critérios estão preenchidos. A pressão vai variar apenas na direção do fluxo, se não houver gradientes de pressão lateral na entrada. Isto pode ser avaliada utilizando corantes ou partículas no caminho de fluxo. Além disso, para experimentos de fluxo contínuo, um amortecedor de pulso é inserido no circuito de fluxo. O amortecedor de pulso tira a maior parte do pulsatility causada pela bomba de roletes no circuito, e nos permite a assunção aproximado de fluxo constante. De nota, o amortecedor de pulso utilizada deve ser compatível com a bomba e tubos utilizados no circuito, de modo que ele pode efetivamente eliminar pulsações no fluxo de saída para as freqüências específicas da bomba de rolete. Em nossa demonstração do Masterflex L / S amortecedor de pulsações atinge fluxo laminar, quando utilizado na linha de descarga com qualquer bomba série Masterflex L / S (0-600 RPMs) e I / P tubo 26. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes. Para o fluxo pulsátil, uma bomba programável pode ser usado para gerar formas de onda diferentes. Além disso, o circuito é projetado de tal forma que as amostras de perfusato pode ser facilmente coletadas em momentos diferentes sem o risco de contaminação das células ou médio fluxo. No nosso exemplo, a concentração de NO 2 - foi medido por quimioluminescência comum Ionics / Sievers Analyzer óxido nítrico (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), como descrito anteriormente 10. O redutor usado para análise de nitrito foi de iodeto de potássio em ácido acético (14,5 M de ácido acético e 0,05 M KI), que tem o potencial de redução para converter o nitrito a NO, mas é insuficiente para reduzir qualquer óxidos de nitrogênio superiores tais como o nitrato e, portanto, é relativamente específico para nitrito. O nitrito total produzido foi calculado como o produto da concentração produzida eo volume total do circuito, enquanto o ajuste de volume perdido, enquanto a recolha de amostras 6. Os passos seguintes são críticos para a execução bem sucedida de experimentos de fluxo: <ol class="lroman"><li> É desejável para evitar formação de bolhas durante o fluxo de set-up, uma vez que as bolhas têm o potencial para arrancar as células de sua superfície. Isto pode ser evitado tomando cuidado ao colocar a parte superior da câmara de fluxo para a parte inferior, o que é melhorrealizado, mantendo ambos paralelos entre si e diminuindo o topo para o fundo em um movimento sem reajustes. Ao fazer isso, pequenas bolhas de ar que possam estar presentes e / ou flutuando no canal de fluxo, serão desviados para as armadilhas de bolha em cada extremidade da carcaça de alumínio. </li><li> É importante assegurar que a tubulação de saída do reservatório desce para o fundo do reservatório. Caso contrário, o ar pode ser sugado para dentro do tubo que conduz a partir de reservatório para a câmara se o nível de perfusato cai ligeiramente abaixo da extremidade da tubulação. </li><li> O pesquisador deve estar familiarizado com a direção do fluxo da bomba para que a bomba não acidentalmente correr na direção oposta ao início do fluxo, o que resultaria no ar sendo sugado para dentro do circuito e de câmara. </li><li> Para evitar a formação de espuma (devido às proteínas desnaturadas contidas no soro), aconselhamos baixar o tubo que conduz da câmara para o reservatório a aproximadamente uma polegada acima do perfusate de nível dentro do reservatório. No entanto, mantendo-o acima do nível médio de fluxo lhe permite verificar o fluxo no reservatório durante o experimento. </li><li> Quando unir as peças de câmara em conjunto, é importante agarrar firme a habitação com uma das mãos ao operar a chave de fenda elétrica com a outra mão. Note que o movimento da chave de fenda elétrica será traduzido em torque que tem o potencial de &quot;arremessar a câmara em torno de&quot; uma vez que o parafuso é apertado. </li><li> Para evitar qualquer ondas de pressão de formação no circuito e levantamento de células fora de sua superfície, assegurar que todas as torneiras estão abertos antes de iniciar o fluxo. </li><li> Especialmente para estudos de fluxo de longo prazo (&gt; 48 horas) recomendamos o uso do tubo mais duro e mais resistente para ser inserido na cabeça da bomba para impedir a quebra da tubulação. </li><li> É possível que os tubos &#39;migra&#39; dentro da cabeça da bomba devido a mal-ajustadas dentes cabeça da bomba. Portanto, sugerimos prestando muita atenção à forma como a banheiraing é garantido na cabeça da bomba e marcar cada extremidade do tubo com uma caneta marca de tal forma que você pode facilmente perceber se o tubo é &#39;puxado&#39; ou deslocada durante o experimento. </li><li> Sempre verifique cuidadosamente cada conector único do circuito e da câmara antes de iniciar a perfusão, a fim de evitar fugas de perfusato durante um experimento devido a uma conexão defeituosa. Isto é especialmente importante para os conectores de entrada e saída de amortecedores de pulso! </li><li> Lembre-se de limitar a exposição à luz, se você usar etiquetas fluorescentes. </li></ol> Uma possível limitação do nosso câmara de fluxo é que a altura é fixado pela altura do canal usinado no alumínio. No entanto, este tem a vantagem de não ter que verificar e ajustar a altura do canal antes de cada experiência e, portanto, simplifica os cálculos tensão de cisalhamento por apenas ajustando o fluxo da bomba para o valor desejado. Dependendo de seus objetivos de pesquisa, pode ser desejávelaumentar a tensão de cisalhamento sem aumentar a velocidade da bomba. Neste caso, recomendamos o aumento da viscosidade do perfusato é, por exemplo, a adição de dextran a 11 médio. Uma possível limitação do circuito de fluxo é o grande volume de meio utilizado, que pode ser problemático quando se tenta quantificar concentrações muito pequenas de metabólitos celulares. Embora não seja mostrado aqui, é possível reduzir substancialmente o volume do circuito usando um reservatório menor e amortecedor de pulso e diminuir comprimento da tubulação e diâmetro. Além disso, existem vários outros sistemas disponíveis no mercado que podem ser usados ​​para aplicar tensão de cisalhamento de fluidos para células em cultura. Sistemas baseados em microfluídica, por exemplo, o sistema de BioFlux Fluxion, permitem análises simultâneas de células em diferentes canais de fluxo microfluídicos carregado com solução em placas bem atuando como reservatórios de entrada e de saída para estes canais 12,13,14. No entanto, essas e outras microsistemas fluídicos não são compatíveis com lâminas de microscópio padrão e não permitir a recuperação de um número suficientemente grande de células para novas experiências, tais como RT-PCR ou Western Blot. Além disso, eles são menos user-friendly, um custo mínimo de US $ 40.000 e pode chegar a um total de mais de US $ 100.000, dependendo do equipamento acessório. Dois sistemas macrofluidic disponível a partir do FlexCell Internacional Corporation, o Streamer FlexCell e os sistemas FlexFlow, tem sido utilizado com sucesso para estudar células endoteliais 15,16,17, as células humanas anel 18 e 19 fibroblastos em condições de escoamento de fluidos. Um terceiro sistema, disponível através GlycoTech, tem sido utilizada para estudar a adesão de células tumorais 20 e 21 a adesão de leucócitos monocamadas endoteliais. O sistema permite Streamer vários slides para serem executados sob as mesmas condições de tensão de cisalhamento de uma só vez, mas carece de uma janela de visualização e - ao contrário de nossosdesign - não permite a visualização em tempo real de células em fluxo. O sistema FlexFlow tem uma janela de visualização, mas requer um microscópio vertical, que pode não ser o microscópio padrão usado na maioria dos laboratórios. Além disso, o sistema exige uma FlexFlow lamínula célula revestido de ser invertida quando colocado na câmara de fluxo. Isto impede a visualização de células fluorescentes em uma superfície opaca, como o titânio revestido de vidro, que demonstramos em nosso estudo. Por último, o lamínulas especializados precisam ser comprados especificamente para o sistema FlexFlow, que é na faixa de preço de vários mil dólares, similar ao sistema Streamer FlexCell. GlycoTech oferece circular e retangular câmaras de placas paralelas de fluxo, que são significativamente menos caro, mas fabricados a partir de acrílico moldado que não podem ser convenientemente tronco autoclavado como a nossa câmara. De nota, câmaras de fluxo de outras que têm sido descritos para ser autoclavávelparecem impraticáveis, pois requerem especial lentes microscópicas 22,23. O sistema utiliza GlycoTech juntas de borracha de silicone interposta entre as placas superior e inferior, que mudará de espessura com o uso repetido e, portanto, alterar a altura da câmara ao longo do tempo (o fabricante recomenda a compra de novas a cada dez usa). Nossa câmara de alumínio com built-in O-rings permite a completa oposição de placas superior e inferior e altura da câmara garante constante entre experimentos. Por último, bombas de vácuo são necessárias para alcançar um selo à prova de vazamentos em projetos de câmara de fluxo de muitos, incluindo as câmaras GlycoTech, que não são necessárias em nosso projeto. Considerando não mostrado aqui, a câmara de fluxo pode ser mantido sob um microscópio durante o experimento de vazão em tempo real imagens de adesão celular e / ou comportamento. Se isso for desejado, recomendamos usar lâmpadas de calor ou uma almofada de aquecimento sob a câmara para manter a temperatura do perfusato a 37 ° C. Pelelá, a bomba de roletes pode ser substituído por uma bomba de seringa, se não &quot;recirculação&quot; da células ou metabólitos ou droga investigacional ou agentes é desejado 24. Também é possível ao fluxo de células de maneira diferente rotulados sobre células aderentes, por exemplo, plaquetas fluorescentes sobre uma camada de EPCs confluentes (utilizando o ensaio de plaquetas descrito por Achneck et al. 6,25) para avaliar a célula a célula-interação sob tensão de cisalhamento do fluido. Nossa câmara de fluxo combina recursos valiosos de outras câmaras de fluxo disponíveis, como uma porta de amostragem perfusato e uma janela de visualização e tem a importante vantagem de compatibilidade com qualquer um microscópio invertido ou vertical. É totalmente autoclavável e permite experimentos repetidos na altura da câmara constante e sem a necessidade de bombas de vácuo para conseguir um selo à prova de fugas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produtos / Reagentes </td><td> Companhia </td><td> Produto # </td></tr><tr><td> Seringa de 10 ml </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> Seringa 30 ml </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Torneiras </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Liga de alumínio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cultura de células-Pratos (4-bem, rectangular) </td><td> Thermo Scientific; Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Rastreador de celular Laranja </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Organics pesquisa </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Adaptador Luer fêmea </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2mg </td></tr><tr><td> Garrafa de vidro (250ml) com Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubos rígidos </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Solution Stain </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adaptador Luer macho </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1X Médio </td><td> Cellgro </td><td> 15-100-CV </td></tr><tr><td> Acessórios polipropileno farpado </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulso-amortecedor </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Bomba de acionamento (Masterflex L / S disco economia de velocidade variável) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Bomba-Head (Cabeça da bomba Masterflex Fácil Load) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Slide </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubulação macia </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Seringa filtro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Nucleic Acid Orange Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Solução de tripsina Neutralizing </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

O objetivo geral deste método é descrever uma técnica para assunto células aderentes às condições de fluxo laminar e avaliar sua resposta ao cisalhamento de fluidos bem quantificáveis ​​sublinha 1. Nosso projeto de câmara de fluxo e circuito de fluxo (Fig. 1) contém uma região de visualização transparente que permite o teste de adesão celular ea imagem da morfologia das células imediatamente antes de fluxo (Fig. 11A, B), em momentos diferentes durante o fluxo (Fig. 11C) , e depois de fluxo (Fig. 11D). Estes experimentos são ilustrados com cordão umbilical humano derivados do sangue células progenitoras endoteliais (EPCs) e suínos EPCs 2,3. Este método é também aplicável a outros tipos de células aderentes, por exemplo, células musculares lisas (PMEs) ou fibroblastos. A câmara e todas as partes do circuito são facilmente esterilizados com autoclavagem a vapor. Em contraste com outroscâmaras, por exemplo, câmaras de microfluídica, um grande número de células (&gt; 1 milhão, dependendo do tamanho da célula) podem ser recuperados após o experimento de fluxo sob condições estéreis para cultura de células ou de outros experimentos, por exemplo, DNA ou extração de RNA, ou imuno-histoquímica (Fig. 11E), ou microscopia eletrônica de varredura 5. A tensão de cisalhamento pode ser ajustado pela variação da taxa de fluxo do perfusato, a viscosidade do fluido, ou a altura ea largura do canal. Este último pode reduzir o volume de fluido ou necessidades célula, assegurando simultaneamente que unidimensional de fluxo é mantida. Não é necessário para medir a altura da câmara entre os experimentos, uma vez que a altura da câmara não depende do uso de juntas, o que aumenta a facilidade de múltiplas experiências. Além disso, o projeto de circuito facilmente permite a coleta de amostras de perfusato para análise e / ou quantificação de metabólitos secretados pelas células sob exposição ao estresse de fluidos de corte, o óxido nítrico por exemplo (Fig. 12) 6 </sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress at JoVE.com

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Beads separação e Células em dispositivos multi-canal microfluídicos Usando dieletroforese e Fluxo Laminar

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Bioengenharia

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Um dispositivo de câmara de fluxo tridimensional Novel para estudar Chemokine dirigido extravasamento de células circulantes fisiológicos sob condições de fluxo

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Avaliando interação leucócito-endotélio em condições de fluxo em um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Câmara Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Análise de expressão genética das células endoteliais expostos para Shear Stress usando múltiplas câmaras de fluxo paralelo-placa

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Detecção de câncer de ovário usando citometria de fluxo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fracionamento de fluxo de fluxo assimétrico para dimensionamento de nanopartículas de ouro em suspensão

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...