Name: parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress
Uploaded: 2012-01-17T12:00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Joe Owen en el Instrumento Biomédica y Machine Shop por sus incansables esfuerzos en la fabricación y montaje de las piezas de cámara de flujo y Matt Maudsley de Leica Microsystems para asistir en las técnicas de imagen a las células a través de cámaras de flujo. Estamos en deuda con Kevin Collins Servicios de perfusión de Duke y el Dr. Steve Wallace en el Departamento de Ingeniería Biomédica por sus útiles sugerencias sobre el diseño de flujo de circuito. También nos gustaría agradecer a la Fundación Nacional de Ciencias de Posgrado Programa de Becas de Investigación para el apoyo a Alexandra Jantzen y el NIH, por su apoyo a través de subvención &quot;forro autólogo de EPC para mejorar la biocompatibilidad de los dispositivos de asistencia circulatoria&quot; RC1HL099863-01.

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Nuestro circuito de flujo y la cámara de flujo permiten someter a las células adherentes, EPC, por ejemplo, para definir destaca fluido de corte. Desde la cima de la cámara y el fondo son la adhesión transparente, y la morfología de células pueden ser evaluados, ya sea en tiempo real, a través de la propia cámara, o después de un experimento de flujo y el desmontaje de la cámara de flujo. En ese momento, las células pueden ser cosechadas en condiciones estériles y sea resembrado, o para recoger su ADN o ARN, etc, para su posterior análisis. Para conseguir un flujo laminar, el diseño de la cámara debe ser tal que se cumplen varias condiciones. En primer lugar, el flujo debe ser laminar, que se puede verificar mediante el cálculo de su número de Reynolds (Re), que es la relación de fuerzas de inercia a las fuerzas viscosas. (Si predominan las fuerzas viscosas, Re es pequeño y el flujo es laminar o &quot;plenamente desarrollado&quot; - por lo general para Re &lt;2300.Si predominan las fuerzas de inercia, el flujo se vuelve más y más al azar hasta que es turbulento, como es el caso de Re&gt; 4000). Podemos calcular Re acuerdo con la ecuación 3 8, <img alt="La ecuación 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Donde ρ es la densidad del fluido, Q es el caudal, μ es la viscosidad, w y h son la anchura y la altura de la cámara, respectivamente, y D h es el diámetro hidráulico, definido de acuerdo con la ecuación 4 8 <img alt="La ecuación 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> El número de Reynolds de nuestras cámaras de flujo de tres, con alturas que van desde 166 hasta 267 micras, rango de 13,9 a 34,6 en las tasas de flujo calculated para obtener una tensión de corte de 15 dinas / cm 2. En los caudales calculados para una tensión de corte de 100 dinas / cm 2, el número de Reynolds de las cámaras van desde 90,4 hasta 234. Todos estos números de Reynolds es mucho menor que 2300 y cumplen el criterio de flujo laminar. En segundo lugar, para el campo de la velocidad y la tensión de corte para ser independiente de la distancia a lo largo del canal de flujo (es decir, completamente desarrollado), la distancia desde la entrada de fluido a la diapositiva debe ser más largo que la longitud de entrada, e L. Esto puede ser satisfecho mediante el cálculo de la longitud de entrada, de acuerdo con la ecuación 5 9. <img alt="La ecuación 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Para los valores mencionados anteriormente, la longitud de entrada varía de 0,01 a 0,25 cm. En tercer lugar, con el fin de garantizar que la velocidad y el esfuerzo cortante en la dirección lateral no varíansignificativamente del valor de caudal en canal unidimensional (Ph Δ / 2 l), la relación h / w debe ser mucho menor que 1. Para la tensión de cizallamiento promedio bajo condiciones de flujo en dos dimensiones que el 95% de la tensión de cizallamiento en flujo unidimensional, h / w debe ser igual a 0,10, y para la tensión de cizallamiento en condiciones de flujo en dos dimensiones a ser el 97,5% de la tensión de cizallamiento en flujo unidimensional, h / w debe ser igual a 0,05. Con las dimensiones de nuestra cámara de flujo diseñado de 1,7 cm de ancho y 166 a 267 m de altura, se cumplen estos criterios. La presión varía sólo en la dirección del flujo, si no hay gradientes de presión lateral en la entrada. Esto se puede evaluar el uso de tintes o las partículas en la trayectoria del flujo. Además, para los experimentos de flujo continuo, un amortiguador de pulsaciones se inserta en el circuito de flujo. El amortiguador de pulsaciones saca la mayoría de los pulsatility causada por la bomba de rodillos en el circuito, y nos permite aproximar la suposición de flujo constante. Es de destacar que el amortiguador de pulsaciones utilizado debe ser compatible con la bomba y la tubería utilizada en el circuito, así que puede eliminar efectivamente las pulsaciones en el flujo de salida de las frecuencias específicas de la bomba de rodillos. En nuestra demostración de la Masterflex L / S amortiguador de pulsaciones consigue un flujo laminar cuando se utiliza en la línea de descarga con cualquier bomba de la serie Masterflex L / S (0 a 600 RPM) y E / P tubería de 26. Para el flujo pulsátil, una bomba programable se puede utilizar para generar formas de onda diferentes. Para el flujo pulsátil, una bomba programable se puede utilizar para generar formas de onda diferentes. Además, el circuito está diseñado de tal forma que las muestras de perfundido se pueden recoger en diferentes puntos de tiempo sin riesgo de contaminación de las células o fluido. En nuestro ejemplo, la concentración de NO 2 - se midió por quimioluminiscencia conun analizador de Ionics / Sievers Óxido Nítrico (NOA 280, Instrumentos Sievers, Boulder, CO) como se describió previamente 10. El reductor utilizado para el análisis de nitrito se yoduro de potasio en ácido acético (14,5 M de ácido acético y 0,05 M de KI), que tiene el potencial de reducción para convertir nitrato en NO, pero no es suficiente para reducir los óxidos de nitrógeno más altos, tales como nitratos y por lo tanto es relativamente específica para el nitrito. El nitrito cantidad total producida fue calculada como el producto de la concentración de producción y el volumen total del circuito, mientras que el ajuste de volumen que se pierde, mientras que la toma de muestras 6. Los siguientes pasos son esenciales para la exitosa ejecución de los experimentos de flujo: <ol class="lroman"><li> Es deseable evitar la formación de burbujas durante el flujo de set-up, ya que las burbujas tienen el potencial para arrancar las células de su superficie. Esto se puede evitar teniendo cuidado al colocar la parte superior de la cámara de flujo en la parte inferior, que es el mejorlogra manteniendo ambas paralelas entre sí y la reducción de la parte superior en la parte inferior de un movimiento sin reajustes. De este modo, pequeñas burbujas de aire que puedan estar presentes y / o flotando en el canal de flujo, se desviarán en la trampa de burbujas en cada extremo de la carcasa de aluminio. </li><li> Es importante asegurarse de que el tubo de salida en el depósito llega hasta el fondo del embalse. De lo contrario, el aire puede ser absorbido en el tubo que conduce desde el depósito a la cámara si el nivel de perfusión cae ligeramente por debajo del extremo del tubo. </li><li> El investigador debe estar familiarizado con la dirección del flujo de la bomba para que la bomba no querer correr en la dirección opuesta al inicio del flujo, lo que resultaría en aire que es aspirado en el circuito y la cámara. </li><li> Para evitar la formación de espuma (debido a las proteínas desnaturalizadas contenidas en el suero) se recomienda bajar la tubería que va desde la cámara al depósito de aproximadamente una pulgada por encima de la perfusate nivel en el depósito. Sin embargo, mantenerlo por encima del nivel medio del flujo le permite verificar el flujo en el depósito durante el experimento. </li><li> Al atornillar las piezas de cámara juntos, es importante captar firmemente la caja con una mano mientras se utiliza el destornillador eléctrico con la otra mano. Tenga en cuenta que el movimiento del destornillador eléctrico se traducirá en el par que tiene el potencial de &quot;tirar la cámara alrededor de&quot; una vez que se aprieta el tornillo. </li><li> Para evitar la formación de ondas de presión en el circuito y el levantamiento de las células de su superficie, asegúrese de que todas las llaves de paso están abiertas antes de iniciar el flujo. </li><li> Especialmente para estudios de flujo a largo plazo (&gt; 48 horas) se recomienda utilizar el tubo más difícil y más resistentes que se insertan en el cabezal de la bomba para prevenir la rotura de la tubería. </li><li> Es posible que la tubería &#39;migra&#39; en el interior del cabezal de la bomba debido a la mala cabeza de la bomba ajusta los dientes. Por lo tanto le sugerimos prestar atención a la forma en la bañeraING se asegura en el cabezal de la bomba y el marcado de cada extremo del tubo con un marcador de tal manera que usted puede notar fácilmente si el tubo está &quot;tirado en la &#39;o desplazado durante el experimento. </li><li> Siempre revise cuidadosamente cada conector individual del circuito y la cámara antes de comenzar la perfusión con el fin de evitar la fuga de perfusión durante un experimento, debido a una conexión defectuosa. Esto es especialmente importante para los conectores de entrada y salida de amortiguadores de pulso! </li><li> Recuerde que debe limitar la exposición de la luz si se utiliza marcadores fluorescentes. </li></ol> Una posible limitación de nuestra cámara de flujo es que la altura es determinada por la altura del canal de mecanizado en el aluminio. Sin embargo, esto tiene la ventaja de no tener que verificar y ajustar la altura del canal antes de cada experimento y por lo tanto, simplifica los cálculos de esfuerzo cortante con sólo ajustar el caudal de la bomba al valor deseado. Dependiendo de los objetivos de su investigación, puede ser deseable paraaumento de la tensión de corte, sin aumento de velocidad de la bomba. En este caso se recomienda aumentar la viscosidad de la perfusión, por ejemplo, la adición de dextrano en el medio 11. Una posible limitación del circuito de flujo es el gran volumen de medio utilizado, que puede ser problemático cuando se trata de cuantificar las concentraciones muy pequeñas de metabolitos celulares. Aunque no se muestra aquí, es posible reducir sustancialmente el volumen de circuitos mediante el uso de un pequeño embalse y amortiguador de pulsaciones y la disminución de longitud de la tubería y el diámetro. Además, hay otros sistemas disponibles en el mercado que pueden utilizarse para aplicar la tensión de corte de fluido de las células en cultivo. Microfluidos basada en los sistemas, por ejemplo, el sistema de BioFlux Fluxion, permitir el análisis simultáneo de las células en diferentes canales de flujo de microfluidos cargado con solución en placas que actúan como entrada y salida de depósitos de estos canales 12,13,14. Sin embargo, estos y otros microsistemas de fluidos no son compatibles con el microscopio estándar y no permite la recuperación de un número suficiente de células para nuevos experimentos, como RT-PCR o Western Blot. Además, es menos fácil de usar, el costo mínimo de $ 40.000 y puede llegar a un total de más de $ 100,000, dependiendo del equipo accesorio. Dos sistemas macrofluidic disponibles de la Corporación FlexCell Internacional, el Streamer FlexCell y los sistemas de FlexFlow, se han utilizado con éxito para estudiar las células endoteliales 15,16,17, las células del anillo 18 y los fibroblastos 19 bajo condiciones de flujo de fluidos. Un tercer sistema, disponible a través de GlycoTech, se ha utilizado para estudiar la adhesión de células tumorales 20 y adhesión de los leucocitos de 21 a monocapas endoteliales. El sistema de Streamer permite a varias diapositivas que se ejecutan bajo las condiciones de estrés misma corte de una vez, pero carece de una ventana de visualización y - a diferencia de nuestrosdiseño - no permite la visualización en tiempo real de las células bajo flujo. El sistema FlexFlow tiene una ventana de visualización, sino que requiere un microscopio vertical, que podría no ser el microscopio estándar que se utiliza en la mayoría de los laboratorios. Además, el sistema FlexFlow requiere un cubreobjetos recubiertos de células que se invierte cuando se coloca en la cámara de flujo. Esto impide la visualización de las células fluorescentes en una superficie opaca, como el titanio recubierto de vidrio, que se demuestra en nuestro estudio. Por último, la cubierta se desliza especializados tienen que ser comprados específicamente para el sistema FlexFlow, que está en el rango de precio de varios miles de millones de dólares, similar al sistema de Streamer FlexCell. GlycoTech ofrece circulares y rectangulares placas paralelas cámaras de flujo, que son mucho menos costosos, pero fabricados en material acrílico fundido que no pueden ser convenientemente madre autoclave como la nuestra cámara. Es de destacar que otras cámaras de flujo que se han descrito para ser autoclavableparece poco práctico, ya que requieren especial lentes microscópicas 22,23. El sistema utiliza GlycoTech juntas de goma de silicona se interpuso entre las placas superior e inferior, que se cambio en el espesor con el uso repetido y por lo tanto, cambiar la altura de la cámara a través del tiempo (el fabricante recomienda la adquisición de otras nuevas después de cada diez usos). Nuestra cámara de aluminio con una función de anillos permite la completa oposición de las placas superior e inferior y se asegura la altura de la cámara constante entre los experimentos. Por último, las bombas de vacío son necesarias para lograr un sellado a prueba de fugas en muchos diseños de cámara de flujo, incluyendo las cámaras de GlycoTech, que no son necesarios en nuestro diseño. Mientras que no se muestra aquí, la cámara de flujo se pueden mantener bajo el microscopio durante el experimento de caudal de imágenes en tiempo real de la adhesión celular y / o comportamiento. Si se desea, se recomienda utilizar lámparas de calor o una almohadilla de calefacción en la cámara para mantener la temperatura perfundido a 37 ° C. Pielallí, la bomba de rodillos puede ser sustituida por una bomba de jeringa, si no &quot;recirculación&quot; de cualquiera de las células o de sus metabolitos o fármacos en investigación o agentes que se desea 24. También es posible que el flujo de las células etiquetadas de forma diferente en las células adherentes, por ejemplo, las plaquetas fluorescente sobre una capa de EPCs confluentes (utilizando el ensayo de plaquetas descrito por Achneck et al. 6,25) para evaluar la célula a célula de interacción bajo una tensión cortante del fluido. Nuestra cámara de flujo combina las valiosas aportaciones de otras cámaras de flujo disponibles, tales como un puerto de muestreo perfusión y un visor, tiene la importante ventaja de la compatibilidad, ya sea con un microscopio invertido o vertical. Es totalmente autoclavable y permite experimentos repetidos a la altura de la cámara constante y sin necesidad de bombas de vacío para obtener un sellado hermético.

<table border="1"><tbody><tr><td> Productos / Reactivos </td><td> Empresa </td><td> Producto # </td></tr><tr><td> 10 ml jeringa </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Vía Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml jeringa </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> Camino de 4 Llaves </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Aleación de aluminio </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> De cultivo celular platos (4-así, rectangular) </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Celular Rastreador de naranja </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Research Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Adaptador Luer hembra </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Botellas de vidrio (250 ml) con tapa </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Tubos duro </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst manchas Solución </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Adaptador Luer macho </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1x Media </td><td> Cellgro </td><td> 15 a 100 CV </td></tr><tr><td> Accesorios de púas de polipropileno </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Rings </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Amortiguador de impulsos </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Bomba-Drive (Masterflex L / S de velocidad variable impulsar la economía) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Bomba-Head (Masterflex Fácil cabezal de la bomba de carga) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Diapositiva </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Tubos flexibles </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Filtro de jeringa </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox Acid Orange nucleicos manchas </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Neutralizar la solución de tripsina </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

El objetivo general de este método consiste en describir una técnica de someter a las células adherentes a las condiciones de flujo laminar y evaluar su respuesta al corte de fluido y cuantificables tensiones 1. Nuestro diseño de la cámara de flujo y un circuito de flujo (Fig. 1) contiene una zona de visualización transparente, que permite realizar pruebas de adhesión celular y la imagen de la morfología de las células inmediatamente antes del flujo (Fig. 11A, B), en varios momentos durante el flujo (Fig. 11C) , y después de flujo (Fig. 11D). Estos experimentos se ilustran con el cordón umbilical humano derivados de la sangre las células progenitoras endoteliales (CPE) y CPE porcino 2,3. Este método también es aplicable a otros tipos de células adherentes, por ejemplo, células de músculo liso (SMC) o fibroblastos. La cámara y todas las partes del circuito son fácilmente esterilizados con autoclave de vapor. A diferencia de otroscámaras, por ejemplo, cámaras de microfluidos, un gran número de células (&gt; 1 millón, dependiendo del tamaño celular) se puede recuperar después del experimento de flujo bajo condiciones estériles para el cultivo celular o de otros experimentos, por ejemplo, ADN o la extracción de ARN, o inmunohistoquímica (Fig. 11E), o microscopía electrónica de barrido 5. El esfuerzo de corte se puede ajustar mediante la variación de la velocidad de flujo de la perfusión, la viscosidad del fluido, o la altura y la anchura del canal. Este último puede reducir el volumen de líquido o de las necesidades de la celda al tiempo que garantiza que el flujo unidimensional se mantiene. No es necesario medir la altura de la cámara entre los experimentos, ya que la altura de la cámara no depende de la utilización de las juntas, lo que aumenta enormemente la facilidad de múltiples experimentos. Además, el diseño del circuito permite fácilmente la toma de muestras para el análisis de perfusión y / o cuantificación de los metabolitos secretados por las células en la exposición de fluidos esfuerzo cortante, por ejemplo, óxido nítrico (Fig. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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Bioengineering

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