Name: following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00
Duration: 6 min 10 s
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Wir sind dankbar, dass Michael Feiss und Jean Sippy für die Führung auf Phagen Erstellung und Reinigung. Wir danken Michael Elowitz für die Bereitstellung der Zell-Erkennung Software, Schnitzcell. Der Welch Foundation (Grant Q-1759) und Human Frontier Science: Arbeit in der Golding Labor ist durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01GM082837), der National Science Foundation (Center für Physik von lebenden Zellen 082265, PFC) unterstützt Program (RGY 70/2008).

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bakterienstämme, Phagen und Plasmide: Stamm LE392 ist supF. Es wurde gewählt, um die Sam7 Mutation im Phagengenoms unterdrücken (siehe Tabelle 1 für weitere Details). So wird induzierten Lysogene schließlich lysieren und lassen Phagenpartikel, ebenso wie infizierte Zellen, die die lytischen Weg gewählt haben. Lysogenen Zellen werden bei 30 ° C aufgrund der Anwesenheit des temperaturempfindlichen cI 857-Allel im Phagengenom. Nach Wärmeinduktion werden gpD-EYFP und Wildtyp gpD aus dem Genom von λ LZ1 und dem Plasmid pPlate * D jeweils coexprimiert. Als Ergebnis enthält das Kapsid des neugeschaffenen Phagen λ LZ2 eine Mischung aus gpD-EYFP und gpD Proteine. Dieses Mosaik Phagen ist strukturell stabil und ausreichend Fluoreszenz auf die Detektion von einzelnen Phagen 5 zu ermöglichen. pP RE - mCherry ist ein Reporterplasmid zur Wahl des lysogenen pathwa erkenneny. Der Promotor P RE wird durch CII beim Aufbau Lysogenie 1,11 aktiviert. pP RE - mCherry 5 wurde aus pE-gfp 11 durch Austausch gfp mit mCherry 12 abgeleitet. Für weitere Details siehe unseren früheren Arbeiten 5. Growth Zustand Parameter: Während Lysogen Induktion (Abschnitt 1), gibt milde Schütteln bei 180 rpm ein guter Virus Ausbeute 13. Verwenden von Glucose im Wachstumsmedium sollte als Glucosemetabolismus vermieden werden erzeugt sauren Stoffwechselprodukte, und reife Lambda Partikel sind instabil bei saurem pH 13. Die Zugabe von MgSO 4 wird zur Stabilisierung des Phagen-Kapsid 3 ab. Für tragende Phagen cI Wildtyp (statt cI 857), kann die induzierte Lysogen Verwendung der DNA-schädigende Mittel Mitomycin C 3 ist. Im Schritt 1.3 wird die Inkubation bei 37 ° C normalerweise nicht länger als 90 Minuten. Es ist usef<html> ul die Zelldichte von OD 600 Check alle 30 min. Für eine gute Lysat sinkt OD 600 auf etwa 0,2 oder weniger, und der verbleibende OD 600 ist ein Ergebnis der Zelltrümmer. Inkubation zu lange in einer niedrigeren Phagen Ertrag führen, da die neu geschaffene Phagen können beginnen, ihre DNA in Zelltrümmer zu injizieren. Um ein sichtbares Phagen Band (mindestens 1 x 10 11 Phagenpartikel) in den Schritten 2.11 und 2,13 zu erhalten, wachsen mindestens 500 ml Kultur in Schritt 1.2. Der Zusatz von 0,2% Maltose in das Wachstumsmedium in den Schritten 5.1 und 5.2 an die Induktion der Expression des LamB, der Rezeptor für den Phagen Lambda-Adsorption 3,14 abzielen. MCherry - das 1000-fache Verdünnung statt 100-fach in Schritt 5.2 wird zur Verringerung der mCherry Hintergrundpegels von der Reporterplasmid pP RE abzielen. In Schritt 5.5 für Phagen DNA-Injektion auslöst, 35 ° C gewählt wird, um die Induktion des temperatursensitiven cI857 Allel vermeiden. Phage Reinigung: jove_content &quot;&gt; Die Phagen Reinigungsschritte (Schritte 2.1 bis 2.11) können mit anderen Aufreinigungsprotokolle 5 ersetzt werden, aber die endgültige Ultrazentrifugation durch CsCl Gradienten Gleichgewicht (Schritte 2.12 und 2.13) ist unvermeidbar. Ausschwingrotoren in den Schritten 2.10 und 2.12 bis benötigten sorgen für scharfe sichtbar Phagen Bands. Erhalt einer reinen Phagen Lager kann leicht bis zu einer Woche, so ist es notwendig, die Phagentiter auf dem Weg zu überprüfen, um sicherzustellen, dass nichts schief geht während der Zwischenschritte. Phage Handhabung: Bei allen Reinigungsverfahren in Abschnitt 2, ist es wichtig zu handhaben Phagen vorsichtig Lysat zu vermeiden Scher Phagen tails aus Phagen Köpfe. Während Zellinfektion in Abschnitt 5 (zB Schritte 5.5 bis 5.7), ist es auch wichtig, um die Scherung von Phagenpartikeln aus der infizierten Zelle zu vermeiden. Beachten Sie, dass, wenn der Phage aus der infizierten Zelle nach dem Injizieren seine DNA geschert wird, das Ergebnis ein &quot;dunkel&quot; Infektion ist, dh der infection Ergebnis wird im Experiment beobachtet werden, aber die Infektion Phagen nicht. Um solche Probleme zu minimieren, verwenden wir eine breite Pipettenspitze Beim Einsatz von Phagen oder Phagen / Zellgemisch. DAPI Testing: Färbung des Phagen Lager mit DAPI (Abschnitt 4) ist eine schnelle und effiziente Methode, um die Reinheit des Phagen Lieferverfügbarkeit überprüfen. Es kann auch verwendet werden, um mögliche Abbau eines bestehenden Phagen Lager über die Zeit zu testen. Lager für ein reines, sollte die Ko-Lokalisation von YFP und DAPI-Signale unter dem Fluoreszenzmikroskop nahe 100% liegen. Wir beobachten, dass typischerweise weniger als 1% der YFP Spots enthalten keine DAPI (repräsentiert Kapside ohne Virusgenom), was bedeutet, dass diese Teilchen nicht erfolgreich verpacken virale DNA anzeigt oder bereits ihre DNA injiziert anderswo. Weniger als 1% der DAPI-Spots enthalten keine YFP (entsprechend nicht fluoreszierenden Phagen). Ist dies nicht der Fall ist, die Schritte 2,12 bis 2,14 Notwendigkeit, in o wiederholt werdenrder wieder zu reinigen. Im Hinblick auf die Bildparameter, ist das Mikroskop Setup in Schritt 4,3 nicht so kritisch wie in Abschnitt 5, da keine langfristigen live-cell imaging hier erforderlich ist. Allerdings halten die gleichen Mikroskopie Einstellungen wie in Abschnitt 5 ist nützlich, wenn man wünscht, die Fluoreszenzintensität eines einzelnen Phagenpartikel zu kalibrieren. Falls der PBS-Agarose Bramme nicht sehr sauber oder zu sehr DAPI Farbstoff verwendet wird, können einige DAPI Stellen entsprechend Phagen-DNA mit einem &quot;Halo&quot; umgeben sein. Wenn zu wenig DAPI Farbstoff verwendet wird, kann das Signal von der DAPI-Kanal sehr schwach sein. Microscope System: Für die Bildgebung in Abschnitt 6, verwenden wir eine kommerzielle invertierten Epifluoreszenzmikroskop (Eclipse TE2000-E, Nikon) mit einer 100x-Objektiv (Plan Fluo, numerische Apertur 1,40, Öl-Immersion) und Standard-Filter-Sets (Nikon). Die Fluoreszenz Lichtquelle eine Bogenlampe mit Steuerung der Lichtintensität. Die folgenden Funktionen sind computergesteuert: x, y und z position; Hellfeld-und Fluoreszenz-Shutter und Fluoreszenz-Filter Wahl. Eine Autofokus-Funktion erforderlich ist. Andernfalls kann der Fokus leicht abdriften während der Zeitraffer-Film (in der Regel 4 Stunden lang). Die Möglichkeit, mehrere (x, y)-Positionen zu jedem Zeitpunkt zu erwerben ist nützlich, da sie mehrere Infektionsereignissen parallel verfolgen können. Wir in der Regel erwerben 8 Bühne Positionen in jedem Film, nach bis zu 100 Infektionen Veranstaltungen. Die Kamera, die wir verwenden, ist eine gekühlte 512x512 CCD mit 16x16 um Pixel-Kamera mit einem Dynamikbereich von 16 Bit (Cascade512, Photometrics). Akquisition unter Verwendung MetaMorph Software (Molecular Devices). Das Mikroskop sollte in einem temperierten Raum gestellt werden, alternativ der Mikroskoptisch sollte durch eine temperaturgesteuerte Kammer umgeben sein. Image Acquisition: Für Live-Cell-Imaging, ist es wichtig, um unnötige Belastung der Probe, die Bleich-und pho führen könntetotoxicity. Daher ist es am besten, zuerst zu charakterisieren Ihr System, um eine optimale Belichtung, die für die Fluoreszenz-Detektion ermöglicht zwar nicht was zu übermäßigen Bleichen oder Hemmung des Zellwachstums zu finden. Um eine gute Fluoreszenz-Bild zu erhalten, mit dem spannenden Lichtintensität, Belichtungszeit und Kamera Gewinn spielen. In den Schritten von 6,2 bis 6,3, wird das Gestell 10 min Intervall für den Zweck der Minimierung Belichtung gewählt. In jedem Rahmen ist nur ein einziger In-Fokus-Bild im Phasenkontrastmikroskop (für Zellerkennung) und fluoreszierenden Kanäle (zum Bestimmen Zellschicksals) benötigt. In dem ersten Zeitpunkt sind jedoch mehrere Bilder z-Position durch den Kanal YFP erforderlich, um alle infizierenden Phagen an der Zelloberfläche zu erfassen. Die YFP Belichtungszeit im Anfangs-Rahmen müssen gegebenenfalls auch höher sein als die für den Zeitraffer-Film in den späteren Zeitrahmen verwendet. Image Analysis: Sehr genau rechnen Phagenpartikel Umgebung der Zelloberfläche in Schritt 7.1. Alsbereits erwähnt, nehmen wir eine Reihe von Z-Stapel durch YFP-Kanal in Schritt 6.2. Dies kann jedoch noch verlassen einige fluoreszierende Phagenpartikel out-of-focus, die die Zählung herausfordert. Die Zellenlänge in der anfänglichen Zeitspanne wird gemessen unter Verwendung des Metamorph Software. Die Zelle kann auch durch Länge ImageJ oder andere Software-Tools zu messen. Zusätzlich kann ein automatisiertes Haus gebaut Matlab Programm sehr nützlich sein, Informationen zu erhalten, wie Fluoreszenz-Änderung über die Zeit entlang Zelllinien.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM-Puffer </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Nadel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Dialysekassette </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-durchsichtigen Schlauch </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-durchsichtigen Schlauch </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti Rotors </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti Rotors </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifluoreszenzmikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien und Ausrüstung.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

Das System umfasst Bakteriophagen (Phage) Lambda und das Bakterium E. coli ist seit langem als ein Paradigma für die Zell-Schicksal Bestimmung 1,2 serviert. Nach der simultanen Infektion der Zelle durch eine Anzahl von Phagen wird einer der zwei Pfade ausgewählt lytischen (virulenten) oder lysogenen (ruhenden) 3,4. Wir haben kürzlich eine Methode entwickelt, Fluoreszenzmarkierung einzelnen Phagen und konnten die nach der Infektion Entscheidung in Echtzeit unter dem Mikroskop zu untersuchen, auf der Ebene der einzelnen Phagen und Zellen 5. Hier beschreiben wir die ganze Prozedur für die Durchführung der Infektion Experimente in unseren früheren Arbeiten 5 beschrieben. Dazu gehören die Schaffung von fluoreszierenden Phagen, Infektion der Zellen, Bildgebung unter dem Mikroskop und Datenanalyse. Das fluoreszierende Phage ist ein &quot;Hybrid&quot;-, Co-exprimierenden Wildtyp und YFP-fusion Versionen des Kapsids gpD Protein. Eine grobe Phagenlysat wird zunächst durch Induktion einer Lysogen der gpD-EYFP (Enh erhaltenWEITERFÜHRENDE Yellow Fluorescent Protein) Phagen, ein Plasmid, die Wildtyp-gpD. Eine Reihe von Reinigungsschritte werden dann durchgeführt, gefolgt von DAPI-Kennzeichnung und Bildgebung unter dem Mikroskop. Dies wird getan, um die Gleichmäßigkeit, DNA Verpackungseffizienz, Fluoreszenzsignal und strukturelle Stabilität des Phagen Lager verifizieren. Die anfängliche Adsorption der Phagen an Bakterien wird auf Eis durchgeführt, dann gefolgt von einer kurzen Inkubation bei 35 ° C, um virale DNA-Injektion 6 auslösen. Die Phagen / Bakterien Gemisch wird dann auf die Oberfläche einer dünnen Nähr-Agar-Platte, bedeckt mit einem Deckglas und abgebildet unter einem Epifluoreszenzmikroskop bewegt. Die nach der Infektion Prozess wird für 4 Stunden folgte, bei 10 min Intervall. Mehrstufige Positionen nachgeführt, so dass ~ 100 Zellen Infektionen in einem einzigen Experiment zurückgeführt werden kann. An jeder Position und Zeitpunkt werden die Bilder in der Phasenkontrast-und rot und grün fluoreszierendes Kanäle erfasst. Die Phasenkontrast-Bild wird später für die automatisierte cel verwendetl Anerkennung während die fluoreszierenden Kanäle verwendet werden, um die Infektion zu charakterisieren Ergebnis: Herstellung neuer fluoreszierenden Phagen (grün) durch Zelllyse oder Expression Lysogenie Faktoren (rot) durch Wiederaufnahme Zellwachstum und-teilung folgt. Die erworbenen Zeitraffer-Filme verarbeitet werden mit einer Kombination aus manuellen und automatisierten Methoden. Datenanalyse führt zur Identifizierung einer Infektion Parameter für jeden Infektion Ereignis (z. B. Anzahl und Positionen der infizierenden Phagen) sowie Infektion Ergebnis (Lyse / Lysogenie). Zusätzliche Parameter extrahiert werden, falls gewünscht.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren zur Herstellung eines fluoreszenzmarkierten Version des Bakteriophagen Lambda, Infektion<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien nach der Infektion Ergebnis unter dem Mikroskop, und die Analyse von Infektion führt.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

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