Name: following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Michael Feiss och Jean Sippy för vägledning om fag skapande och rening. Vi tackar Michael Elowitz för att tillhandahålla programvaran celligenkänning, Schnitzcell. Arbetet i Golding labbet stöds av anslag från National Institutes of Health (R01GM082837), National Science Foundation (082.265, PFC: Centrum för Fysik av levande celler), Welch Foundation (Grant Q-1759) och Human Frontier Science Program (RGY 70/2008).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Bakteriestammar, fag och plasmider: Stam LE392 är supF. Det valdes för att undertrycka Sam7 mutationen i faggenomet (se tabell 1 för detaljer). Således kommer inducerade lysogener lyserar småningom och släpper fagpartiklar, liksom infekterade celler som har valt den lytiska vägen. Lysogena celler odlas vid 30 ° C på grund av närvaron av den temperaturkänsliga cl 857-allelen i faggenomet. Efter värmeinduktion, är gpD-EYFP och vild typ gpD samuttrycks från genomet av λ LZ1 och plasmiden pPlate * D resp. Som ett resultat, innehåller kapsiden av den nyligen skapade fagen λ LZ2 en blandning av gpD-EYFP och gpd proteiner. Denna mosaik fag är strukturellt stabil och tillräckligt fluorescerande för att möjliggöra detektion av enskilda fager 5. pP RE - mCherry är en reporter plasmid används för att upptäcka val av lysogena pathway.. Promotorn P RE aktiveras av CII under upprättandet av lysogeny 1,11. pP RE - mCherry 5 härleddes från Pe-GFP 11 genom att ersätta GFP med mCherry 12. För mer information se vår tidigare arbete 5. Tillväxt Konditionsparameter: Under lysogen induktion (avsnitt 1), ger milda skakning vid 180 rpm en bra virusutbyte 13. Användning av glukos i tillväxtmediet bör undvikas eftersom glukosmetabolismen genererar sura metaboliska produkter, och mogna lambda partiklar är instabila vid surt pH 13. Tillsatsen av MgSO 4 syftar till att stabilisera fagkapsiden 3. För fager som bär vild typ cl (i stället för cl 857), kan lysogenen induceras med användning av DNA-skadande medlet mitomycin C 3. I steg 1,3, inkuberingen vid 37 ° C bör normalt inte överstiga 90 minuter. Det är usef<html> ul att kontrollera celldensiteten genom OD 600 var 30 min. För en god lysat, sjunker OD 600 till cirka 0,2 eller mindre, och de återstående OD 600 är ett resultat av celldebris. Inkubation alltför länge kan resultera i en lägre fag utbyte eftersom den nyskapade fagen kan börja att injicera deras DNA i cellrester. För att erhålla en synlig fag band (minst 1 x 10 11 fagpartiklar) i steg 2,11 och 2,13, växa minst 500 ml kultur i steg 1,2. Tillsatsen av 0,2% maltos i tillväxtmediet i steg 5,1 och 5,2 syftar till att inducera uttryck av lamm, receptorn för fag lambda adsorption 3,14. Den 1000-faldig utspädning i stället för 100-faldigt i steg 5,2 syftar till att minska mCherry bakgrundsnivån från reporterplasmid pP RE - mCherry. I steg 5,5 för fag DNA-injektion triggning, 35 ° C valts för att undvika induktion av den temperaturkänsliga cI857-allelen. Fag Rening: jove_content &quot;&gt; De fag reningssteg (steg 2,1 genom 2,11) kan ersättas med andra reningsprotokoll 5, men den slutliga ultracentrifugering genom CsCI jämvikt gradient (steg 2,12 och 2,13) ​​är oundviklig. behövs i steg 2,10 och 2,12 till Swinging bucket rotorer säkerställa skarpa synliga fag band. Skaffa en ren fag lager lätt kan ta upp till en vecka, så det är nödvändigt att kontrollera fag-titern på vägen att se till att ingenting går fel under de mellanliggande stegen. Fag Hantering: Under alla reningsförfaranden i avsnitt 2, är det viktigt att hantera faglysat försiktigt för att undvika klippning fag svansar från faghuvuden. Under cellinfektion i avsnitt 5 (t.ex., stegen 5,5 till 5,7), är det också viktigt att undvika skjuvning av fagpartiklar från den infekterade cellen. Observera att om fagen skjuvas från den infekterade cellen efter injicering dess DNA, är resultatet en &quot;mörk&quot; infektion, dvs ifection resultatet kommer att observeras i experiment, men den infekterande fagen inte. För att minimera sådana problem, använder vi ett brett pipettspets när hanteringen fager eller fag / cellblandningen. DAPI Test: Färgning av fag lager med DAPI (avsnitt 4) är en snabb och effektiv metod för att kontrollera renhet fag lager. Den kan också användas för att testa för eventuell nedbrytning av en existerande fag lager över tiden. För en ren bestånd bör samlokalisering av YFP och DAPI-signaler enligt fluorescensmikroskop vara nära 100%. Vi observerar typiskt att mindre än 1% av YFP fläckarna inte innehåller DAPI (representerande kapsider utan det virala genomet), vilket tyder på att dessa partiklar inte klarade paketera viralt DNA eller hade redan injicerat deras DNA annanstans. Mindre än 1% av DAPI fläckarna inte innehåller YFP (motsvarande icke-fluorescerande fager). Om så inte är fallet, steg 2,12 till 2,14 behöver upprepas i order att rena igen. När det gäller avbildning parametrar är mikroskopet inställningen i steg 4,3 inte lika kritisk som i avsnitt 5 eftersom ingen långsiktig live-cell imaging krävs här. Men att hålla samma mikroskopi inställningar som i avsnitt 5 är användbar om man vill kalibrera fluorescensintensiteten av en enda fagpartikel. Om PBS-agaros platta är inte mycket ren, eller för mycket DAPI färgämne används, kan vissa DAPI fläckar motsvarande fag-DNA omges med en &quot;halo&quot;. Om alltför lite DAPI färgämne används, kan signalen från DAPI-kanalen vara mycket svag. Mikroskop System: För avbildning i avsnitt 6, använder vi en kommersiell inverterat epifluorescensmikroskop (Eclipse TE2000-E, Nikon) med en 100x mål (Plan Fluo, numerisk apertur 1,40, oljeimmersion) och standard filter set (Nikon). Fluorescensen ljuskällan är en båglampa med kontroll av ljusintensitet. Följande funktioner är datorstyrd: x, y och z posättningen, ljusfält och fluorescens fönsterluckor, och fluorescens filter val. En autofokus funktionen krävs. Annars kan fokus glida lätt bort under time-lapse film (normalt 4 timmar lång). Möjligheten att förvärva flera (x, y) positioner vid varje tidpunkt är användbar, eftersom den gör det möjligt att följa flera infektion händelser parallellt. Vi förvärvar vanligtvis 8 steg positioner i varje film, efter upp till 100 infektion händelser. Kameran vi använder är en kyld 512x512 CCD med 16x16 um pixel kamera med ett dynamiskt omfång av 16 bitar (Cascade512, ljustekniska). Förvärvet sker med Metamorph mjukvara (Molecular Devices). Mikroskopet skall placeras i en temperatur-kontrollerad rum, alternativt skall mikroskopets vara omgiven av en temperatur-kontrollerad kammare. Bild Förvärv: För levande cell imaging, är det viktigt att undvika onödig exponering av provet, vilket kan leda till blekning och phototoxicity. Därför är det bäst att först karakterisera systemet för att hitta en optimal ljusexponering som möjliggör fluorescensdetektion utan leder till överdriven blekning eller hämma celltillväxt. För att få en bra fluorescens bild spela med spännande ljusintensitet, exponeringstid och kamera vinst. I steg 6,2-6,3 är 10 minuter ramintervall valts för att minimera ljusexponering. I varje bildruta är bara en enda i-fokus bild behövs i fas-kontrast (för cell erkännande) och fluorescerande kanaler (för bestämning av cellens öde). I den första tidpunkten, är dock flera z-positionen bilder genom YFP-kanalen som krävs för att fånga alla infekterande fager på cellytan. Den YFP exponeringstiden i den inledande ramen kan också behöva vara högre än den som används för time-lapse film i de senare tidsramar. Bildanalys: Mycket noggrant räkna fagpartiklar runt cellytan i steg 7,1. Somnämnts ovan tar vi en serie av z-stackar genom YFP-kanal i steg 6,2. Detta kan dock lämnar fortfarande en del fluorescerande fagpartiklar utanför fokus, som utmanar räkningen. Cellen längd i första tidsramen mäts med Metamorph programmet. Cellen längd kan också mätas genom ImageJ eller andra programverktyg. Dessutom kan en automatisk hem byggt Matlab-programmet vara mycket användbara för att erhålla information såsom fluorescens förändras över tid tillsammans cellinjer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNas I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNas </td><td> Sigma </td><td> R4642-10 mg </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM-buffert </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Spruta </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309.585 </td></tr><tr><td> Nål </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305.176 </td></tr><tr><td> Dialys kassett </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66.333 </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agaros </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-klart rör </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344.060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-klart rör </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344.062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331.302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335.649 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifluorescensmikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Reagenser och utrustning.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

Systemet innefattar bakteriofag (fag) lambda och bakterien E. E. coli har länge varit ett paradigm för cell-ödet bestämma 1,2. Efter samtidig infektion av cellen av ett antal fager, är en av två vägar som valts: lytiskt (virulent) eller lysogen (vilande) 3,4. Vi har nyligen utvecklat en metod för att fluorescent märkning enskilda fager, och kunde undersöka efter infektion beslut i realtid under mikroskop, på enskilda fager och celler 5. Här beskriver vi den fullständiga förfarandet för att utföra infektionen experimenten beskrivna i vårt tidigare arbete 5. Detta innefattar skapandet av fluorescerande fager, infektion av cellerna, avbildning under mikroskop och dataanalys. Den fluorescerande fagen är en &quot;hybrid&quot;, co-uttryckande vildtyp och YFP-fusion versioner av kapsid gpD-proteinet. En rå faglysat först erhålls genom att inducera en lysogen av GPD-EYFP (enhbalanseras Gul fluorescerande protein) fag, hyser en plasmid som uttrycker vildtyp gpD. En serie reningssteg utförs sedan, följt av DAPI-märkning och avbildning under mikroskopet. Detta görs för att kontrollera likformigheten, DNA-förpackning effektivitet, fluorescenssignal och strukturell stabilitet av fag beståndet. Den initiala adsorption av fager till bakterier utförs på is, sedan följt av en kort inkubation vid 35 ° C för att utlösa viralt DNA-injektion 6. Fagen / bakterier blandning förflyttas sedan till ytan av en tunn näringsagar platta, täckt med ett täckglas och avbildas i ett epifluorescensmikroskop. Den post-infektionsprocessen följs under 4 timmar, vid 10 min intervall. Flera steg positioner spåras så att ~ 100 cell infektioner kan spåras i ett enda experiment. Vid varje position och tidpunkt, är bilder som förvärvats i fas-kontrast och röda och gröna fluorescerande kanaler. Den faskontrast bild används senare för automatiserad celL erkännande medan de fluorescerande kanaler används för att karakterisera infektionen resultat: produktion av nya fluorescerande fager (grön) följt av cell-lys, eller uttryck för lysogeny faktorer (röd) följt av återupptagen celltillväxt och delning. De förvärvade tidsfördröjda filmer bearbetas med hjälp av en kombination av manuella och automatiserade metoder. Dataanalys resulterar i att identifiera infektion parametrar för varje infektion händelse (t.ex. antal och positioner att infektera fager) samt infektion resultat (lys / lysogeny). Ytterligare parametrar kan extraheras, om så önskas.

Watch this Scientific Journal Video about Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda at JoVE.com

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

I den här artikeln beskrivs hur du förbereder en fluorescensmärkt version av bakteriofag lambda, infektion i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Bakterier, efter infektionen resultatet under mikroskop, och analys av infektion resultat.

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Övervakning av immunceller Trafficking Lysrör Prion Spön timmar efter intraperitoneal Infektion

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Användning av artificiell Sputum Medium för att testa antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I villkor som är mer relevanta för cystisk fibros Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Skalbar hög genomströmning Urval Från faguppvisade Syntetiska Antibody bibliotek

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Icke-invasiv Modell av Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Fag Phenomics: Fysiologiska Approaches att karaktärisera Novel virusproteiner

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Omvandling av probiotiska Jäst och deras återhämtning från Gastrointestinal Immune Vävnader Efter oral sondmatning hos möss

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Livsmedelsburna patogener Screening med Magneto-fluorescerande Nanosensor: Snabb påvisande av E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisande av entrohemoragiska Escherichia Coli koloniseringen i murina mottagande av icke-invasiva In Vivo Mareld System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Skapandet av en tät Transposon införande bibliotek med bakteriell konjugation i Enterobacterial stammar som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...