Name: orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי קנוט אליס ולנברג קרן המועצה למחקר שוודי.

1. שיבוט של היתוך היעד gene/ABDz1-tagged לבנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שברי PCR של הגן ABDz1 מוקף אתרי הגבלה מתאים קשירת N-מסוף הגן היעד בביטוי פלסמיד (א ABDz1 פלסמיד המכיל זמין באופן חופשי באמצעות הסכם העברת חומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב מטוהרים ביטוי וקטור ושברי PCR עם אנזימי הגבלה נבחר חיץ תגובה הולמת. לטהר את המוצרים לפני קשירת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור שבר מוגבלת ABDz1 לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן של עניין להפוך את המוצר קשירת ל E. coli (בשיטה המקורית זן RR1ΔM15 שימש 8). מורחים תאים טרנספורמציה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR מסך מושבות אחדות ורצף לאמת את הקלטת הביטוי וכתוצאה מכך על ידי רצפי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פלסמיד מתרבות הלילה של verif רצףהמושבה ied ולהפוך לזן הביטוי המועדף (ב E. coli השיטה המקורית רוזטה (DE3), אירוח pRARE פלסמיד כדי לשפר את הייצור של החלבונים המקודדים על ידי הגנים האנושיים, שימשו). </li></ol> 2. חלבון הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך 10 מ&quot;ל של מרק סויה tryptic בתוספת תמצית g / l 5 שמרים אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בסל&quot;ד 150 ב 37 ° C למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 1 מ&quot;ל של תרבות לילה בינוני 100 מ&quot;ל ו טרי להשרות ביטוי חלבון (במקור 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside כאשר operon החלבי נוצל) כאשר התאים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בסל&quot;ד 150 במהירות של 25 תאים ° C במשך הלילה הקציר על ידי צנטריפוגה. </li></ol> 3. זיקה אורתוגונלית טיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בתוך חיץ 25 מ&quot;ל ריצה (25 מ&quot;מ טריס-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w / v) Tween 20, pH 8.0) ולשבש הדואר תאים על ידי sonication ב משרעת 60% ו 1.0/1.0 פולסים דקות 3. צנטריפוגה מדגם ולסנן את חלבון המטרה המכיל supernatant (0.45 מיקרומטר) לפני טיהור נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בין 1 מ&quot;ל HSA טור Sepharose או עמודה NHS פעילה, יחד בעבר עם HSA על פי המלצות של הספק, עם 10 כרכים עמודה (CV) של הפעלת המאגר ב 1 מ&quot;ל / דקה על מערכת טיהור חלבונים מתאים. טען את lysate חיידקי ב 0.5 מ&quot;ל / דק &#39;ולאחר מכן לאפס את קצב הזרימה עד 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ רץ ואחריו 5 קורות חיים של חיץ כביסה (5 מ&quot;מ NH 4 Ac, pH 5.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המדגם עם חיץ elution (0.5 מ &#39;HAc, pH 2.5) בשעה 1 מ&quot;ל / דקה לאסוף את השברים, הקליטה לפקח על 280 ננומטר לבחור שברים מהפסגה eluted לטיהור נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים עם ריכוז החלבון הגבוהה ביותר, לדלל פעמיים במאגר ריצה בטח (20 פוספט מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.2) ולוודא pH הוא בסביבות נייטרלי. הוסף 1 M טריס-HCl pH 8 להגדיל את ה-pH במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם על 0.5 mL / min על טור 1 HiTrap מ&quot;ל MabSelect בטח כי כבר equilibrated עם קורות חיים של 10 חיץ לרוץ בטח בבית 1 מ&quot;ל / דקה. אפס את קצב הזרימה עד 1 מ&quot;ל / דקה לאחר הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ ריצה בטח (שלב 5) ו elute את החלבונים עם 0.2 מ &#39;HAc, pH 2.7. עבור חלבונים יעד רגיש eluate ניתן לנטרל ישירות על ידי תוספת של טריס-HCl על האוסף. </li></ol> אם הפעולות chromatographic מתהפכים eluate מ MabSelect את הטור בטח יכול להיות מדולל מפעיל המאגר (שלב 3.1) ו-pH עלה ל סביב 8 על ידי תוספת של 1 M טריס-HCl. באופן כללי, פסגות צרה הם נצפו כאשר המטריצה ​​בטח מועסק בשלב השני. 4. הערכת טוהר על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השברים מטוהרים עלהפחתת SDS-PAGE, ואם תרצה, לנתח את משקל מולקולרי של המוצר מטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסה. חשוב להפחית באופן מלא את המדגם מאז ציסטאין חופשי ABDz1 עלול לגרום dimerization של המוצר תחת אי - הפחתת התנאים. </li></ol> 5. נציג תוצאות: כהוכחה עקרוני, טיהור זיקה אורתוגונליים בהנחיית תג ABDz1 הוערך במשך שלושה חלבונים היעד האנושי המייצג כיתות מסיסות שונה, משקולות מולקולרית נקודות isoelectric (טבלה 1). הגן היה ABDz1 התמזגו גנטית הגנים היעד המבנים התבטאו החיידק, תרשים 2 מציג תרשים זרימה של כל השלבים השיטה ברציפות. לאחר טיהור ידי פרוטוקול אורתוגונליים, דגימות שנאספו בנקודות שונות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 3). התוצאות מראות בבירור את התועלת של תג כפולה בשני שלבים לטיהור מאוד ספציפיות. למרות טוהר סבירה achieved לאחר שלב הטיהור הראשוני כפי שניתן לראות מן הג&#39;לים, הצעד רצופים התשואות מוצר טהור מאוד גם מתאים מאוד יישומים תובעניים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" /> באיור 1. עיצוב הספרייה קומבינטורית המשמש מבחר של תג ABDz1 bispecific. 46 אמינו אלבומין מחייב חומצה תחום מתקפל לחבילה של שלושה יציב הסליל והוא מכיל אתר קשירה עבור אלבומין בסרום האדם נמצא בעיקר הסליל השני. עד גנטית אקראי eleven משטח חשוף חומצות אמיניות הממוקם הסליל הראשון והשלישי, משטח מחייב הרומן תוכנן. באחת עשרה תפקידים מצוינים באיור ממוספרות לפי Kraulis et al. 9. בעקבות biopanning נגד דימר של תחום-Z של חלבון staphylococcal עם הספרייה קומבינטורית הביע על הפאג, את המולקולה bispecific ABDz1 זוהה. <iמ&quot;ג alt = &quot;איור 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg&quot; /&gt; באיור 2. תרשים זרימה פשוט עבור פרוטוקול זיקה אורתוגונליים טיהור. PCR-קטע המכיל את רצף ABDz1 הוא ligated (N-סופני) עם הגן של עניין וקטור ביטוי מתאים. המוצר קשירת הופך ל E. coli לאימות רצף והכנת פלסמיד. בעקבות השינוי לארח ביטוי, תרבות בקנה מידה גדול עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מוגדר מתרבות לילה ראשונית. חיידקים נקצרים על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication לייצר lysate בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה. לאחר שלב הסינון כדי להסיר חלקיקים מוצקים שיורית, lysate הוא נתון טיהור זיקה אורתוגונליים על מערכת טיפול הנוזל על ידי עובר שני צעדים טיהור ברציפות. פסגות eluted משני השלבים לטיהור נדגמים הוערכו על ידי SDS-PAGE כדי להעריך את טוהר לעומת tהוא lysate לפני הטיהור. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" /> באיור 3. SDS-PAGE ניתוח של חלבונים היעד הביע וטיהר ב היתוך עם ABDz1. דגימות שנלקחו lysate החיידק של שלושה חלבונים ביטוי היתוך ABDz1, המייצגים תכונות שונות, ואת תג ABDz1 עצמה נאספו יחד עם דגימות הפסגות המתאימה טיהור על עמודה HSA ואחריו MabSelect בטוחה עמודה (A) . Lanes 1-4 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 5-8 מתוך טיהור HSA (השלב ​​הראשון) ואת נתיבי 9-12 מתוך טיהור MabSelect בטח (השלב ​​השני). דוגמאות נטענים, לפי הסדר הבא: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ו ABDz1. בנוסף, רכשה דגימות מן lysates אותו מטוהרים בסדר הפוך על עמודות זהה נותחו (B). Lanes 1-3 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 4-6 וrom MabSelect טיהור בטוחה (השלב ​​הראשון) ואת הסמטאות 7-9 מתוך טיהור HSA (השלב ​​השני). דוגמאות הועמסו באותו סדר כמו ב (א) אלא את תג עצמו אינו כלול. מתוך תוצאות אלה ברור כי בשיטה זו שני שלבים התשואות חלבונים מטוהרים ללא סדר הפעולות מוחלים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ב </td><td> יעד חלבון Uniprot ג </td><td> מולקולרית משקל (KDA) </td><td> מסיסות בכיתה ד </td><td> מולקולרית משקל המוצר של היתוך (KDA) </td><td> Isoelectric נקודה המוצר היתוך </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17.4 </td><td> 4 </td><td> 23.7 </td><td> 8.5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10.8 </td><td> 3 </td><td> 17.1 </td><td> 4.9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8.9 </td><td> 5 </td><td> 15.2 </td><td> 6.8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקל מולקולרי של תג ABDz1 לבדו הוא 6.3 kDa, הצבע isoelectric 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון מטרה מייצג חלק של החלבון Uniprot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיסות מעמד של שבר חלבון עם N-ABP מסוף 6 שלו 10. </li></ol> טבלה 1. חלבונים יעד ומוצרי היתוך עם תג ABDz1 להעריך הוכחה במחקר העיקרון. שלושה חלבונים אנושיים ייחודיים עם משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric נבחרו ביטוי וטיהור על ידי הגישה את הזיקה אורתוגונליים.

<ol>
	<li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+most+of+affinity+tags.">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification.">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li><li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+chelate+affinity+chromatography,+a+new+approach+to+protein+fractionation.">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li><li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin.">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li><li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein.">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li><li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification.">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+affinity+domains+for+the+detection,+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins.">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li><li>R&#252;ther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts.">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li><li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle:+a+heteronuclear+NMR+study.">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein.">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li><li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins.">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li><li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery.">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li><li>Gr&#228;slund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery.">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזיקה אורתוגונליים טיהור פרוטוקול המוצג כאן מאפשר טיהור יעיל של מגוון רחב של חלבונים היעד. על ידי שילוב של אתר הקישור הטבועה תחום אלבומין מחייב עם משטח מחייב רומן, תג קטן חלבון bispecific פותחה. זה מאוד פשוט לנצל את תג שכן הוא יכול פשוט לשכפל ו לידי ביטוי היתוך חלבון כלשהו של עניין וקטור כל ביטוי מועדף. ציוד סטנדרטי זמין ברוב המעבדות יכול להיות מועסק לטיהור שני שלבים החלבון. מאז פונקציה של תג ABDz1 תלוי קיפול נכון של התחום ביעילות לחשוף משטחים שני שלה מחייב, השיטה היא מוגבלת חלבונים לידי ביטוי בצורה מסיסים ולא מתאים purifications בתנאים denaturing. סוכני צמצום יש להימנע גם משום שהם מפריעים מחייב של ABDz1 לתחום-Z על המטריצה ​​MabSelect בטח. אורתוגונלית זיקה purification מספק אלטרנטיבה יעילה בשיטות מסורתיות על מנת לספק את הדרישות של חלבונים מטוהרים מאוד יישומים תובעניים רבים. במקביל, שיטה זו מבטלת את הצורך תיוג קומבינטורית כאשר אסטרטגיות טיהור שונים משמשים ברציפות. עבור יישומים הדורשים חלבון מטרה הילידים, אתר מחשוף פרוטאז עשויים להיות הציג לעבד הסרת האנזימטית של תג ABDz1 האפשר 11. יתר על כן, תג ABDz1 הוא התחום הראשון bispecific חלבון קטן מקופל שתואר עד כה. זה ייחודי משום שהוא מספק אסטרטגיה לטיהור תלויה בשני אינטראקציות יעד ספציפי זיקה. בעתיד זה יהיה מעניין להרחיב את הרעיון הזה על ידי פיתוח התגיות bispecific הרומן החדש מחייב לבצע משטחים התואמות שרפים chromatographic זמינה וזולה. לדוגמה, על ידי החלפת חומצות אמינו מעורב מחייב אלבומין עם שאריות בסיסיים, תג תואם iבבורסה כרומטוגרפיה ניתן להשגה. רעיון דומה הוכח יעיל על ידי הממונה על תחום הנדסת-Z כדי ליצור תגי הידוע בשם Z חומצה 12 ו-Z בסיסי 13 תואם חילופי אניון ו קטיון, בהתאמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> התרבות האמריקאית סוג אוסף </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli רוזטה (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> סויה Tryptic מרק </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> הרטט sonicator תא </td><td> Sonics וחומרים </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia ביוטק </td><td> לשעבר מוצר </td></tr><tr><td> HiTrap בטח MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> NHS המופעל HiTrap HP עמודה </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag

בשל העלויות הגבוהות הקשורות טיהור של חלבונים רקומביננטי הפרוטוקולים צריכים להיות רציונלית. עבור תפוקה גבוהה המאמצים יש ביקוש עבור שיטות כלליות שאינן דורשות חלבון המטרה אופטימיזציה ספציפיות 1. כדי להשיג זאת, תגי לטיהור גנטית יכול להיות התמזגו אל הגן של עניין משמשות 2. ידית זיקה הנפוץ ביותר הוא תג ששה היסטידין, אשר מתאים טיהור תחת שני תנאים מקומיים denaturing 3. נטל מטבולי להפקת תג הוא נמוך, אבל זה לא מספק כמו סגוליות גבוהה כמו המתחרות 1,2 זיקה כרומטוגרפיה אסטרטגיות מבוססות. כאן, תג טיהור bispecific עם שני אתרי קישור שונים על חומצת אמינו 46, תחום חלבון קטן פותחה. תחום אלבומין מחייב נגזרת חלבון G סטרפטוקוקלי ויש לו זיקה חזקה הטבועה אלבומין בסרום אדם(HSA). עשר משטח חשוף חומצות אמינו, לא מעורב אלבומין מחייב 4, חולקו באקראי גנטית כדי לייצר ספריה קומבינטורית. הספרייה חלבון עם הרומן מסודרים באופן אקראי פני השטח מחייבים (איור 1) באה לידי ביטוי על חלקיקים phage כדי להקל על הבחירה של קלסרים על ידי טכנולוגיית התצוגה phage. באמצעות מספר סבבי biopanning נגד dimeric-Z תחום הנגזרות חלבון staphylococcal 5, מולקולה קטנה, bispecific עם זיקה הן HSA ויעד רומן זוהה 6. חלבון הרומן תחום, המכונה ABDz1, הוערך כתגית טיהור לבחירה של חלבונים עם יעד משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric. שלושה חלבונים היעד התבטאו coli Escherishia עם תג רומן התמזגו שלהם N-Termini ואילך זיקה מטוהרים. טיהור ראשוני על עמודה או עם HSA משותק או Z-תחום הביא relatiהמוצרים טהור vely. שני שלבים זיקה טיהור עם תג bispecific הביאו לשיפור משמעותי של טוהר חלבון. התקשורת chromatographic עם ה-Z תחום משותקת, עבור MabSelect למשל בטוח, זמינים לטיהור של נוגדנים HSA יכול בקלות להיות יחד כימית התקשורת לספק את המטריצה ​​השנייה. שיטה זו היא יתרון במיוחד כאשר יש ביקוש גבוה על טוהר חלבון המטרה התאושש. Bifunctionality של התג מאפשר chromatographic שני צעדים שונים כדי לשמש בעוד נטל על חילוף החומרים מארח את הביטוי מוגבל בשל גודל קטן של התג. הוא מספק חלופה תחרותית עד שנקרא תיוג קומבינטורית תגי שם מרובים בשילוב 1,7.

Watch this Scientific Journal Video about Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag at JoVE.com

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...